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《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)》2016年第3期

摘要：

采用響應(yīng)面法對(duì)林蛙油生物活性肽的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)活性肽進(jìn)行抗疲勞作用研究。結(jié)果表明：超聲波輔助酶法制備林蛙油生物活性肽，木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為料液比1%、酶用量0.3%、溫度60℃、時(shí)間4h、pH5.5，水解度為13.5%。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明：高劑量組小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間是對(duì)照組的2.3倍，低劑量組的轉(zhuǎn)棒時(shí)間是對(duì)照組小鼠的2.73倍，中劑量組小鼠的爬桿時(shí)間是對(duì)照組的2.8倍；小鼠的血清尿素氮和血乳酸含量分別減小了72.7%和86.5%，說明林蛙油生物活性肽能夠緩解疲勞感的產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞：

林蛙油；生物活性肽；抗疲勞作用

隨著生活節(jié)奏的加快及工作壓力的增加，人們?cè)絹碓饺菀赘杏X到疲勞，這種現(xiàn)象與機(jī)體能量消耗和狀態(tài)修復(fù)有直接關(guān)系[1-4]，疲勞現(xiàn)象產(chǎn)生后，可以導(dǎo)致機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力降低、中樞神經(jīng)系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)源減少、神經(jīng)肌肉接點(diǎn)效率降低等[5]，如不及時(shí)對(duì)疲勞現(xiàn)象進(jìn)行狀態(tài)修復(fù)會(huì)對(duì)機(jī)體的骨骼肌、心肌等造成危害[6,7]，如慢性疲勞綜合癥（CFS）就是由于疲勞現(xiàn)象所引起的疾病[[8,9]。生物活性肽作為一種天然制備產(chǎn)物無毒副作用備受關(guān)注，研究表明生物活性肽具有抑菌、抗癌、抗疲勞、抗氧化、降膽固醇等生理功能[10-12]。林蛙油味甘、性平，系雌性林蛙的干燥輸卵管，其主要成分是蛋白質(zhì)，研究表明，蛋白質(zhì)在人體內(nèi)要水解為小分子肽才能更好的發(fā)揮其生理作用，因此本研究采用酶工程的方法以林蛙油為原料將其水解為肽類物質(zhì)，并通過動(dòng)物試驗(yàn)研究其抗疲勞作用。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

1.1.1試驗(yàn)材料林蛙油長白山北亞藥業(yè)有限公司；木瓜蛋白酶（400U/mg），購自上海鼎國生物工程有限公司；其他均為分析純，購自上海鼎國生物工程有限公司。尿素氮試劑盒，購自長春匯力生物技術(shù)有限公司；血乳酸試劑盒，購自南京建成生物技術(shù)有限公司。

1.1.2儀器設(shè)備infinitieM200酶標(biāo)儀，NanoQuant；FE20KpH計(jì)，瑞士梅特勒；Z36HK型高速離心機(jī)，德國HERMLE公司；FD-1B50型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康儀器有限公司；UV-1700型分光光度計(jì)，日本島津。

1.2方法

1.2.1林蛙油生物活性肽的制備工藝準(zhǔn)確稱取適量林蛙油，按照一定料液比混合發(fā)制，打漿，超聲波（400W）處理30min，進(jìn)行木瓜蛋白酶水解，4h后沸水浴滅酶15min，冷卻后4500r/min離心15min，將上清液冷凍干燥備用[13]。

1.2.2茚三酮法測(cè)定林蛙油生物活性肽的水解度（DH）[14]將烘干至恒重的甘氨酸稀釋成2-20μg/mL的溶液用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)；取2mL稀釋液和1mL顯色劑于試管中，充分混勻后沸水浴加熱15min，同時(shí)作空白對(duì)照；15min后取出試管冷水迅速冷卻，加入5.0mL40%乙醇溶液混勻后放置15min，用1cm比色杯以空白對(duì)照管調(diào)零于570nm處測(cè)其吸光度作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)。取蛋白水解液0.5mL定容在50mL容量瓶中，取出4mL稀釋液與1.6mL蒸餾水、1.0mL顯色劑混勻于試管中，操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出蛋白水解液中-NH2的含量（μmol/mL）。

1.2.3林蛙油生物活性肽的抗疲勞能力評(píng)價(jià)

1.2.3.1動(dòng)物分組ICR小鼠，體重18-22g，雄性。購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心；試驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組，給藥劑量分別為：低劑量100mg/kg，中劑量200mg/kg，高劑量400mg/kg，對(duì)照組給予蒸餾水，給藥方式為灌胃，受試樣品給予小鼠時(shí)間為30天。

1.2.3.2小鼠負(fù)重力竭游泳抗疲勞試驗(yàn)采用50cm×50cm×40cm游泳箱，水深≥30cm，水溫25℃±1.0℃，末次給予受試樣品30min后，將尾根部負(fù)荷5%體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳。記錄小鼠自游泳開始至死亡的時(shí)間。

1.2.3.3轉(zhuǎn)棒疲勞試驗(yàn)在1.2.3.1中試驗(yàn)動(dòng)物末次給藥后30min上轉(zhuǎn)棒疲勞儀，記錄小鼠在棒時(shí)間。

1.2.3.4爬桿試驗(yàn)在1.2.3.1中試驗(yàn)動(dòng)物末次給藥后30min進(jìn)行爬桿，記錄小鼠在桿時(shí)間。

1.2.3.5血清尿素氮測(cè)定在1.2.3.1中試驗(yàn)動(dòng)物末次給予受試樣品30min后，在溫度30℃游泳箱中不負(fù)重游泳90min，休息60min后，眼球采血。分離血清，按照試劑盒操作方法測(cè)定各組小鼠血清中尿素氮含量。

1.2.3.6血乳酸測(cè)定在1.2.3.1中試驗(yàn)動(dòng)物末次給予受試樣品30min后，采血20μL，在溫度為30℃游泳箱中不負(fù)重游泳10min，立即采血20μL，休息20min后，立即采血20μL。按試劑盒操作方法測(cè)定不同時(shí)間小鼠全血中乳酸含量。

1.2.4統(tǒng)計(jì)處理采用GraphPadPrism軟件系統(tǒng)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，利用方差分析和t檢驗(yàn)等方法對(duì)所獲結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與討論

2.1木瓜蛋白酶水解林蛙油工藝條件

2.1.1料液比對(duì)水解工藝的影響配置料液比分別為0.5:100,1:100,1.5:100,2:100,2.5:100林蛙油蛋白溶液，經(jīng)超聲波預(yù)處理后按加酶量0.3%，酶解時(shí)間3h，酶解溫度60℃處理樣品，研究料液比對(duì)水解工藝的影響。 圖1為不同料液比條件下，林蛙油水解度的變化。由圖可知，隨著料液比的變化對(duì)水解度的影響很大，隨著料液比從0.5:100增加到1:100時(shí)，林蛙油水解度迅速增加，并達(dá)到最高值；隨著料液比的繼續(xù)增大，林蛙油水解度逐漸減小，說明過多的蛋白質(zhì)分子會(huì)形成網(wǎng)狀聚合物抑制酶解反應(yīng)，所以水解林蛙油生物活性肽適宜的料液比為1:100時(shí)。

2.1.2加酶量對(duì)水解工藝的影響從圖2可知隨著加酶量的升高，水解度也隨之增大；當(dāng)加酶量在0.3%時(shí)，林蛙油生物活性肽的生成率達(dá)到了一個(gè)穩(wěn)定水平，此時(shí)酶將蛋白分子幾乎完全催化斷裂，隨著加酶量繼續(xù)升高，對(duì)水解度的影響也不顯著。所以，林蛙油生物活性肽的水解工藝中最適加酶量為0.3%。

2.1.3酶解時(shí)間對(duì)水解工藝的影響如圖3所示，隨著酶解時(shí)間的延長，水解度也越來越高，酶解反應(yīng)在1h到4h之間水解度一直呈上升趨勢(shì)，4h后上升趨勢(shì)明顯變緩不利于蛋白水解，可見反應(yīng)在4h時(shí)已趨于穩(wěn)定。所以選擇酶解時(shí)間為4h為最佳條件。

2.1.4pH對(duì)水解工藝的影響由圖4可知，pH值從4.5增加到5.5，水解度呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)pH值從5.5增加到6.5時(shí)，水解度呈下降趨勢(shì)，說明林蛙油在水解工藝中的適宜pH值為5.5。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化水解工藝條件，考察料液比、加酶量、酶解時(shí)間和pH值對(duì)水解工藝的影響。

2.1.5響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶水解林蛙油工藝本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定各影響因素水平范圍，進(jìn)而優(yōu)化林蛙油生物活性肽的制備工藝，為林蛙油提高水解率提供相關(guān)的理論依據(jù)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平與編碼（表1）以及試驗(yàn)結(jié)果（表2）如下表所示：由表3方差分析結(jié)果可知，本試驗(yàn)所建立的模型顯著（P=0.0241＜0.05）,失擬項(xiàng)不顯著（P=0.1502＞0.05），說明該模型擬合程度較好，可用于木瓜蛋白酶水解林蛙油工藝條件的分析和預(yù)測(cè)。方差分析還表明，回歸模型中A、C2對(duì)Y值的影響極顯著，A2、B2對(duì)Y值的影響顯著。根據(jù)DesignExpert8.0.6軟件分析可得響應(yīng)面的3D和等高線圖，如圖5所示。經(jīng)分析可知，制備林蛙油生物活性肽的最佳條件是：加酶量0.3%，料液比為1:100，酶解時(shí)間為4h，pH為5.5，此時(shí)林蛙油水解度為13.5%。為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，在最佳制備工藝條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)的平均值為13.32%，與預(yù)測(cè)值相近，表明響應(yīng)面法所得的模型準(zhǔn)確可靠。

2.2林蛙油生物活性肽對(duì)小鼠的抗疲勞作用

2.2.1林蛙油生物活性肽對(duì)小鼠負(fù)重游泳的影響負(fù)重力竭游泳試驗(yàn)不僅可以體現(xiàn)機(jī)體的抗疲勞能力，還能反應(yīng)出機(jī)體對(duì)外界不良環(huán)境的抵抗能力和應(yīng)激能力。由表4可知，低、中、高劑量組小鼠在負(fù)重力竭游泳試驗(yàn)中均比對(duì)照組游泳時(shí)間長，其中高劑量組效果最為明顯（p<0.001），是對(duì)照組的2.3倍。各劑量組能夠顯著延長運(yùn)動(dòng)小鼠負(fù)重力竭游泳的時(shí)間，亦可說明林蛙油生物活性肽具有一定的抗疲勞功效。

2.2.2林蛙油生物活性肽對(duì)小鼠轉(zhuǎn)棒疲勞試驗(yàn)的影響小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上的轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)間，是考驗(yàn)小鼠抗疲勞效果的一個(gè)重要指標(biāo)，如表4所示，給予林蛙油生物活性肽的低劑量組小鼠比未給予林蛙油生物活性肽的小鼠具有特別顯著差異，低劑量組的轉(zhuǎn)棒時(shí)間是對(duì)照組小鼠的2.73倍，說明林蛙油生物活性肽具有抗疲勞功效。

2.2.3林蛙油生物活性肽對(duì)小鼠爬桿試驗(yàn)的影響由表4可知，與未給予林蛙油生物活性肽的對(duì)照組相比，低劑量組和高劑量組的小鼠均具有顯著延長爬桿時(shí)間，低劑量組、高劑量組差異顯著（p＜0.05），中劑量組差異達(dá)極顯著（p＜0.01），是對(duì)照組的2.8倍，由此可見林蛙油生物活性肽能顯著延長小鼠的爬桿時(shí)間。

2.2.4血清尿素氮測(cè)定機(jī)體在連續(xù)運(yùn)動(dòng)過程中，由于處于缺氧狀態(tài)下會(huì)造成乳酸和氨的蓄積，導(dǎo)致疲勞感產(chǎn)生[15,16]；乳酸脫氫酶作用于丙酮酸后生成血乳酸，在能量供不應(yīng)求時(shí)，蛋白質(zhì)分解代謝產(chǎn)能生成血清尿素氮。如表5可知，在游泳90min后對(duì)照組小鼠的血清尿素氮含量為5.93mmol/L，低劑量組中血清尿素氮含量繼續(xù)增加至8.96mmol/L，是對(duì)照組的1.5倍，說明小鼠劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)提高血清尿素氮水平，疲勞感急劇加增；中劑量組、高劑量組與對(duì)照組相比，分別減小了26.3%和72.7%，并且中劑量組與對(duì)照組之間差異顯著（p＜0.05），高劑量組與對(duì)照組之間具有極顯著差異（p＜0.01）。結(jié)果表明，灌胃林蛙油生物活性肽可以供給機(jī)體能力，提高小鼠的抗疲勞能力，亦具有一定的抗疲勞功效。

2.2.5血乳酸測(cè)定在長時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)過程中，肌肉耗氧量的增加會(huì)導(dǎo)致機(jī)體缺氧狀態(tài)加速糖酵解產(chǎn)生乳酸，所以乳酸含量越高，疲勞感就越強(qiáng)[17,18]。表6是分別測(cè)定小鼠在游泳前、游泳時(shí)、游泳后血乳酸含量，結(jié)果表明：游泳前中劑量組的血乳酸相比于對(duì)照組減小了86.5%，效果極其顯著；游泳后，高劑量組相比于對(duì)照組減小了50%，具有差異顯著性。

3結(jié)論

本研究優(yōu)化了林蛙油生物活性肽的制備工藝，通過響應(yīng)面優(yōu)化工藝為：木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為料液比1%、酶用量0.3%、溫度60℃、時(shí)間4.0h、pH5.5，水解度為13.5%。通過動(dòng)物試驗(yàn)表明，林蛙油經(jīng)過木瓜蛋白酶水解后具有抗疲勞功能。

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作者：姜麗冬 金鑫 樸春紅 王玉華 胡耀輝 于寒松 單位：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院