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1材料與方法

1．1材料與試劑四棱豆，產自湖南懷化地區。復合蛋白酶，主要成分是堿性蛋白酶，酶活力≥120U/mg，上海楷洋生物技術有限公司。藥品:濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、甲醛、硼酸、硼砂、硫酸銅、硫酸鉀，以上試劑均為分析純。指示劑:甲基紅－溴甲酚綠混合指示劑、酚酞指示劑。

1．2主要儀器設備PK－S28型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司;PGG－9070型電熱恒溫古風電熱箱，上海森信實驗儀器郵箱公司;JJ－2組織搗碎勻漿機，上海浦東物理光學儀器廠;HJ－1型磁力加熱攪拌器，江蘇醫療儀器廠;PHS－25型數顯酸度計，杭州雷磁分析儀器廠;HSJ通風柜，深圳市嘉鴻順實業有限公司;電爐，天津市泰斯特儀器有限公司;電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司;分析天平，OHAUSCORPORATIONinSwiterland;SIEMENS冰箱，博西華家用電器有限公司。

1．3試驗方法

1．3．1四棱豆蛋白質溶液的制備稱取適量的四棱豆，用水浸泡24h后剝皮，按料水比1∶7的比例加入蒸餾水，用組織搗碎機打漿3min，然后用潔凈的紗布過濾，將所得四棱豆蛋白質濾液在電爐上加熱30min，即自制的四棱豆蛋白質溶液。待其冷卻后，測定其蛋白質含量，并儲存在冰箱中備用。

1．3．2四棱豆蛋白質溶液的酶解取適量的蛋白質溶液，用2mol/L的NaOH和H2SO4溶液調節至試驗設定的pH值，加入定量的復合蛋白酶，放入設制一定溫度的電熱恒溫水浴鍋中進行反應，水解至預定時間后，將酶解液沸水浴鈍化蛋白酶5min。冷卻放置一段時間后再測定氨基態氮含量。

1．3．3水解度的測定方法粗蛋白含量的測定:采用GB/T15589．2—2008。氨基態氮測定:采用ZBX66038—87《氨基態氮測定法》。水解度的計算方法:水解度(DH)=(游離氨基氮/總氮)×100%。

1．3．4酶解條件的單因素試驗(1)酶用量對酶解反應的影響在pH值為6．0，酶解溫度50℃，酶解時間為4h的酶解條件下，以水解度為指標，設計酶用量為1%、2%、3%、4%、5%、6%，考察不同復合蛋白酶用量(以蛋白質溶液質量為基準，下同)對酶解反應的影響。(2)酶解溫度對酶解反應的影響在復合蛋白酶用量為5%，pH值6．0，酶解時間為4h的酶解條件下，設制溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，以水解度為指標，考察不同溫度對酶解反應的影響。(3)酶解時間對酶解反應的影響在酶解溫度為50℃，pH值為6．0和復合蛋白酶用量為5%的酶解條件下，酶解時間為1h、2h、3h、4h、5h、6h，以水解度為指標，考察不同時間對酶解反應的影響。(4)pH值對酶解反應的影響在酶解時間為5h、酶解溫度為50℃、復合蛋白酶用量為5%的酶解條件下，設計pH值為4、5、6、7、8、9，以水解度為指標，考察不同pH值對酶解反應的影響。

1．3．5復合蛋白酶水解四棱豆蛋白質的正交試驗為了確定復合蛋白酶水解四棱豆蛋白質的最佳條件，在單因素試驗的基礎上進行正交試驗。選擇酶解溫度、pH、復合蛋白酶用量和酶解時間作為正交試驗的4個因素，進行4因素3水平的正交試驗，因素水平表見表1。

1．3．6復合蛋白酶水解四棱豆蛋白質的最佳條件驗證試驗重復上述4因素3水平正交試驗，驗證復合蛋白酶水解四棱豆蛋白質的最佳條件是否正確。

2結果與分析

2．1四棱豆乳濁液中蛋白質的含量將四棱豆去皮以料水比1∶7打成漿過濾，重復3次取樣測定此時乳濁液的蛋白質含量。由表2可知四棱豆在以料水比為1∶7的情況下，四棱豆乳濁液的蛋白質含量為2．89%。

2．2復合蛋白酶水解四棱豆蛋白的單因素試驗

2．2．1酶用量對酶解反應的影響用復合蛋白酶水解四棱豆蛋白質溶液時，酶用量對酶解反應有很大影響。酶用量對酶解反應的試驗結果見圖1。從圖1可以看出，當復合蛋白酶用量小于5%時，四棱豆蛋白質溶液的水解度隨著復合蛋白酶用量的增加迅速增大;當復合蛋白酶用量大于5%時，四棱豆蛋白質溶液的水解度隨著酶用量的增加并沒有顯著增大。這是由于酶量增加，酶與底物作用得更充分，提高了酶對不溶性蛋白的作用能力，隨著酶量的繼續增加，酶與底物的作用達到飽和，反應達到最大，即使再增加酶量，四棱豆蛋白質溶液的水解度變化也不會明顯。因此，考慮到經濟成本以及對資源的有效利用，復合蛋白酶用量為5%時，酶解反應效果最為理想。

2．2．2酶解溫度對酶解反應的影響酶解溫度對復合蛋白酶活性的影響很大。隨著溫度的升高，酶催化反應速度加快，至達到最大反應速率為止，高溫時酶反應速度減小，這是酶本身由于高溫變性所致。試驗結果見圖2。從圖2可以看出，當溫度為50℃時，四棱豆蛋白質溶液的水解度達到最高值。當低于50℃時，隨著溫度的提高，蛋白酶的酶活增加，酶對底物的作用效果增強，四棱豆蛋白質溶液的水解度隨之增加;當溫度高于50℃時，酶活性逐漸降低，四棱豆蛋白質溶液的水解度降低，同時過高的溫度會使酶的活性中心結構被破壞導致酶變性，部分或全部失去催化活性，因此初步確定最適酶解溫度為50℃。

2．2．3酶解時間對酶解反應的影響酶解時間也是影響復合蛋白酶水解四棱豆蛋白質溶液的重要影響因素之一。合適的酶解時間能夠有效地提高生產效率，節省成本。試驗結果見圖3。從圖3可以看出，當酶解時間小于5h時，四棱豆蛋白質溶液的水解度隨著時間的增加逐漸增大;當酶解時間大于5h時，四棱豆蛋白質溶液的水解度隨著時間的延長變化不大。這是因為隨著時間的延長，底物不斷減少，酶解充分［13］，因此最適提取時間為5h。

2．2．4pH值對酶解反應的影響同溫度一樣，pH值對復合蛋白酶的活性影響也很大。過酸過堿都會影響酶蛋白的構象，甚至會使酶變性失活。當pH值變化不是很劇烈時，酶雖未變性，但活力會受到影響，從而抑制或促進酶解反應。試驗結果見圖4。從圖4可以看出，pH值對水解度的影響較大。當pH值小于或大于7．0時，復合蛋白酶的活性受到抑制，致使水解度降低。在pH值為7．0時，四棱豆蛋白質溶液的水解度達到最大值。因此，復合蛋白酶水解四棱豆蛋白質時，調節pH值為7．0左右時，效果最佳。

2．3復合蛋白酶水解四棱豆蛋白質最佳水解條件優化本試驗選擇酶解溫度、pH、復合蛋白酶用量和酶解時間作為正交試驗的4個因素，進行4因素3水平的正交試驗，正交試驗結果見表3。由表3可知，酶解試驗中影響四棱豆水解效果的主次因素為:D＞C＞B＞A，說明在用復合蛋白酶水解四棱豆蛋白質的酶解條件中，因素D即酶解時間為最重要因素;其次分別是因素C和因素B，即復合蛋白酶用量和酶解時的pH值;因素A即酶解溫度為不重要因素。復合蛋白酶水解四棱豆蛋白質的最佳酶解優化工藝參數為A1B2C2D2，即:酶解溫度為45℃，pH值為7．0，復合蛋白酶用量為5%，酶解時間為5h。

2．4復合蛋白酶水解四棱豆蛋白質最佳水解條件驗證結果驗證試驗結果表明:在復合蛋白酶用量為5%、酶解溫度45℃、pH值7．0、酶解時間5h的水解條件下，用復合蛋白酶水解四棱豆蛋白質溶液獲得的酶解液的水解度最高，達到18．59%。故試驗得出的復合蛋白酶水解四棱豆蛋白質的最佳水解條件具有可重復性。

3結論

通過在單因素試驗的基礎上進行4因素3水平的正交試驗，確定了復合蛋白酶水解四棱豆蛋白質的最佳酶解優化工藝參數為酶解溫度為45℃、pH值為7．0、復合蛋白酶用量為5%、酶解時間為5h，水解度可以達到18．59%。

作者：廖盧艷蔣立文單位：湖南農業大學東方科技學院湖南農業大學食品科技學院