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1材料與方法

1．1實驗材料和試劑丙烯酰胺(98%):上海邁瑞爾化學技術有限公司;2－溴丙烯酰胺:上海邁瑞爾化學技術有限公司;溴化鉀、溴酸鉀、乙酸乙酯、無水硫酸鈉、硫代硫酸鈉:天津開通化學試劑有限公司;D－葡萄糖:濟南圣和化工有限公司。

1．2儀器與設備

GC2010氣相色譜儀(配有電子捕獲檢測器):日本島津公司;極性毛細管柱(30m×0．3mm×0．25μm，RTX－WAX):美國Agilent公司;鼓風干燥箱:上海精宏儀器設備廠;KQ－5200E型超聲清洗器:昆山市超聲儀器有限公司。

1．3實驗方法

1．3．1響應面試驗設計及葡萄糖/天冬酰胺模擬反應體系的建立以加熱溫度、加熱時間、天冬酰胺和葡萄糖添加量作為研究因素，采用響應面法(RSM)對葡萄糖/天冬酰胺低濕模擬體系中丙烯酰胺形成規律進行研究;通過擬合二次多項式方程，計算出最優的條件組合以及丙烯酰胺的最大理論產生量。應用Design－Expert8．0．5b軟件，采用CentralCompositeDesign(CCD)進行試驗設計。模型采用4因素5水平設計，其中中心點重復3次用于估計試驗誤差，每個因素的水平為－2，－1，0，1，2(編碼值)。響應面試驗設計因素與水平見表1。準確稱取天冬酰胺和葡萄糖，充分混勻后，放入小燒杯，置于烘箱中加熱一定時間。反應結束后取出，迅速冷卻至室溫，置于4℃冰箱中備用。加熱溫度、加熱時間、天冬酰胺和葡萄糖的添加量如表1所示。

1．3．2衍生化處理及氣相色譜測定在溴化劑的作用下，丙烯酰胺與溴發生加成反應，生成2－溴丙烯酰胺，可以用氣相色譜檢測。

1．3．2．1反應產物衍生化處理向高溫熱反應后的小燒杯中加入10mL蒸餾水，超聲提取20min。將提取液倒入50mL容量瓶，超聲提取兩次，合并提取液，定容。取5mL提取液于試管中，加入1mL稀硫酸，于4℃冰箱中放置15min;然后加入1．5g溴化鉀和1mL溴酸鉀，渦流混合均勻，4℃下放置150min，再加入1mL硫代硫酸鈉終止反應。用10mL乙酸乙酯提取三次，合并提取液。取2mL提取液倒入小燒杯中，加入1．5g無水硫酸鈉除水。將除水后的乙酸乙酯提取液經0．45μm濾頭過濾后氣相色譜進樣，檢測丙烯酰胺含量。

1．3．2．2丙烯酰胺氣相色譜檢測條件進樣量:1μL(分流比10∶1);載氣及氣流速度:氮氣，1mL/min;進樣口溫度:225℃;檢測口溫度:250℃;程序升溫操作:110℃保留1min，然后以25℃/min的速度升至180℃，保留2min;再以2℃/min的速度升至190℃;最后以25℃/min的速度升至240℃并保留6min。以丙烯酰胺濃度為橫坐標，以對應的2－溴丙烯酰胺的峰面積為縱坐標，做標準曲線。

2結果與分析

2．1單因素實驗結果考察了不同葡萄糖、天冬酰胺添加量、加熱時間、加熱溫度等條件對丙烯酰胺的生成量的影響，結果如圖1～3所示。

2．1．1葡萄糖、天冬酰胺添加比例葡萄糖、天冬酰胺添加量對丙烯酰胺的產生具有重要影響，添加量越高，丙烯酰胺產生量越大。在加熱溫度180℃、加熱時間9min條件下，研究了葡萄糖/天冬酰胺添加量分別為0．6∶1．4、0．8∶1．2、1．0∶1．0、1．2∶0．8、1．4∶0．6(mol/mol)對丙烯酰胺產生的影響作用。由圖1可知，不同葡萄糖/天冬酰胺添加比例(0．6∶1．4、0．8∶1．2、1∶1、1．2∶0．8、1．4∶0．6)對丙烯酰胺產生量影響顯著。當添加比例為1∶1時，丙烯酰胺的生成量最高。因此，后續實驗確定葡萄糖/天冬酰胺添加比例為1∶1。

2．1．2加熱溫度加熱溫度對丙烯酰胺生成量有很大影響。葡萄糖/天冬酰胺比例為1∶1，加熱時間為9min，研究了不同高溫熱處理溫度對丙烯酰胺產生量的影響。由圖2可知，隨著加熱溫度的升高，丙烯酰胺的生成量先升高后下降，加熱溫度在180℃時，丙烯酰胺的生成量最高。因此后續試驗選擇加熱溫度為180℃。

2．1．3加熱時間加熱時間對丙烯酰胺的生成量具有重要影響。葡萄糖/天冬酰胺的混合比例為1∶1，加熱溫度為180℃時，研究了不同加熱時間(6、7、8、9、10min)對丙烯酰胺生成量的影響，結果如圖3所示。由圖3可知，隨著加熱時間的增加，丙烯酰胺的生成量緩慢升高;當加熱時間為9min時，丙烯酰胺的生成量達到最大值，隨后逐漸下降。因此在后續研究中，選擇加熱時間為9min。

2．2方差分析和二次多項回歸方程

根據單因素試驗確定的試驗因素及水平，將加熱溫度、加熱時間、還原糖添加量和天冬酰胺添加量作為自變量，采用CentralCompositeDesign試驗設計4因素5水平的響應面分析試驗，以丙烯酰胺含量為響應值，進行響應面分析，試驗設計及結果見表1。利用Design－Expert8．0．5b軟件，建立響應值與各因素之間的回歸模型(其中X1:加熱溫度，X2:加熱時間，X3:天冬酰胺添加量，X4:葡萄糖添加量)，得到回歸方程為:。對回歸方程進行方差分析，結果見表2。由表2結果可知，該回歸方程模型為極顯著(P＜0．01)，失擬值不顯著(P＞0．05)，說明該回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以用來預測實際樣品中的丙烯酰胺的產生量。由表2中的F值可知，加熱溫度對丙烯酰胺產生的影響最大，其次是天冬酰胺添加量，加熱時間影響作用最小。葡萄糖和天冬酰胺添加量分別為1．2mmol時，由該回歸方程計算得到丙烯酰胺最大產生條件為:加熱溫度200℃，加熱時間6．5min;在此條件下丙烯酰胺的最大理論生成量為674．0nmol。三次驗證試驗的平均值651．6nmol，與理論值基本一致(誤差值為3．4%)，說明預測結果可信。

2．3各因素影響作用分析

各因素與響應值所構成響應面圖可較為直觀地看出各因素對丙烯酰胺含量的影響，曲線越陡峭，表明該因素對響應值的影響越大，結果見圖4。圖4a表明:加熱溫度對丙烯酰胺的生成量有重要影響。在短時高溫的條件下，溫度越高丙烯酰胺的含量越高;在加熱溫度一定的情況下，隨著加熱時間的延長，丙烯酰胺的含量先升高后下降。可能隨著加熱時間的延長，反應產生的丙烯酰胺發生分解或聚合。這將在以后的研究中進行研究確證。圖4b，圖4c表明:丙烯酰胺含量隨著前體物(葡萄糖、天冬酰胺)添加量增加而增加，但增加量不顯著。說明前體物含量對丙烯酰胺產生的影響是通過與加熱溫度、加熱時間的交互作用而起作用的。圖4d，圖4e表明:在加熱時間與葡萄糖(天冬酰胺)添加量的交互影響中，葡萄糖或天冬酰胺的添加量越多，丙烯酰胺的含量越高;隨著加熱時間的延長，丙烯酰胺的含量先升高后下降。圖4f表明:當前體物天冬酰胺和葡萄糖添加量增加時，丙烯酰胺含量升高，但兩種前體物對丙烯酰胺含量的影響不同，在葡萄糖/天冬酰胺低濕模擬體系中，天冬酰胺對丙烯酰胺含量的影響比葡萄糖更大。這與表3研究結果一致。

3結論

在葡萄糖/天冬酰胺低濕模擬體系中，加熱時間、加熱溫度、葡萄糖和天冬酰胺添加量對丙烯酰胺的生產均具有重要影響，其影響程度依次為:加熱溫度＞天冬酰胺添加量＞葡萄糖添加量＞加熱時間。建立的回歸方程具有良好的準確性，可以用來預測實際樣品中丙烯酰胺的產生量。對指導如何控制和降低高溫熱處理食品中丙烯酰胺的含量具有重要意義。

作者：戴炳業左潔張永菊于帆顧姣徐志祥單位：科技部中國農村技術開發中心山東農業大學食品科學與工程學院