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《生物技術雜志》2014年第二期
1方法
1.1藻種培養條件及實驗設置N.oculata選用海水培養基，其余3株藻采用改良BG－11培養基。將培養至對數生長中期的藻細胞離心(3500×g，5
min)收集，用無菌水洗滌后接種，初始接種OD750為0.6，設置3個重復，微藻培養采用3cm柱狀光合生物反應器，通入含1%CO2的壓縮空氣攪拌，使用300μmolphotons•m－2•s－1的光強持續光照，培養溫度25±1℃，培養周期21d。
1.2藻細胞生物質濃度的測定將孔徑為0.45μm的混合纖維濾膜在80℃烘至恒重，取10mL藻液真空抽濾至濾膜，80℃烘至恒重，將兩次結果相減即得細胞干重。
1.3藻細胞色素組成和含量的測定稱取5mg藻粉，加入5mL乙醇振蕩后室溫黑暗中過夜，3500×g離心5min，收集上清色素提取液，用0.45μm濾膜過濾后上柱。采用UltiMate3000HPLC系統，流動相A:乙腈－水(90:10V/V)，流動相B:乙酸乙酯;檢測波長:445nm，波長掃描范圍:300～800nm;柱溫:20℃，流速:1mL•min－1，進樣量:20μl。
1.4藻細胞吸收光譜的測定采用紫外可見分光光度計，測定第6d的4株藻細胞和色素提取液的吸收光譜，藻液調整到相同的OD750，色素提取液調整到相同的OD680，狹縫寬度2nm，掃描速度200nm•min－1。
1.5藻細胞低溫熒光光譜的測定采用日立F－4500熒光分光光度計，在77K溫度下，測定4株藻細胞的低溫熒光光譜，激發波長分別為436nm、470nm，波長掃描范圍:600～750nm。發射波長分別為696nm、715nm、700nm，波長掃描范圍:400～600nm。狹縫寬度2nm，掃描速度240nm•min－1。
1.6藻細胞光合放氧及呼吸速率的測定采用液相氧電極測定光合放氧速率，先用Na2S2O3對氧極的基線進行校準，取適量樣品低速離心，再用含有5mmol/LNaHCO3的相應氮濃度的培養基重懸藻體，測定時間為5min。Chla的測定參見李其雨等人提到的方法，公式為Chla(mg•L－1)=(11.64A663－2.16A645－0.10A630)v/(lV)，其中v為有機溶劑體積，V為藻液體積，l為測定池光程。
1.7數據處理用Origin8.5和SPSS13.0軟件對數據進行統計分析。
2結果與分析
2.14株真眼點藻的生長曲線圖1為4株真眼點藻生物質濃度變化曲線。在培養周期內，隨時間延長各實驗組生物質濃度均先快速上升后緩慢上升。V.helvetica在第18d達到最大生物量7.26g•L－1，其他3株藻則是第21d，分別為9.4g•L－1(E.sp.)、10.42g•L－1(E.polyphem)、7.15g•L－1(N.oculata)，其中E.sp.和E-.polyphem的最大生物量極均顯著高于V.helvetica和N.oculata(p＜0.01)。說明不同生活環境和種屬的4株真眼點藻的生長特性存在一定的差異性。
2.24株真眼點藻的色素組成及含量表24株真眼點藻的色素組成及含量表2為4株真眼點藻的色素組成及含量變化。4株藻均含有Chla、Vio、Vau和β－car。N.oculata的Chla含量顯著高于其余3株藻(p＜0.05)。4株藻的Chla和Vio的含量隨培養時間延長均降低，Chla/β－car和Vio/β－car的值也下降，而N.oculata的Chla/β－car和Vio/β－car均顯著高于其余3株藻(P＜0.05)。說明4株真眼點藻的色素組成一致，但其色素含量存在差異。
2.34株真眼點藻的吸收光譜圖2為N.oculata藻細胞和色素提取液吸收光譜，其余3株藻的掃描結果與其類似(結果中未顯示)。由圖可知，4株藻的細胞和色素提取液吸收光譜中，可見光區均有3個吸收峰，436～440nm和666～680nm分別是Chla在藍、紅光區的吸收峰，470～486nm處則屬于類胡蘿卜素;與色素提取液的最大吸收峰相比，藻細胞的吸收峰均有一定的紅移，這是由于藻細胞中色素與蛋白質的結合而導致的。
2.44株真眼點藻的低溫熒光光譜圖3為4株真眼點藻的低溫熒光發射光譜。由圖3(a)可知，以436nm為激發波長時，E.sp.和V.helvetica的主峰為715nm，肩峰為696nm;而E.polyphem的主峰為696nm，肩峰為715nm;N.oculata只有一個696nm處的發射峰。由圖3(b)可知，以470nm為激發波長時，E.sp.、E.polyphem和V.helvetica均有2個發射峰，主峰為700nm，肩峰為715nm，而N.oculata只有700nm處的一個發射峰。其中696～700nm附近的熒光峰來自PSⅡ，715nm附近的熒光峰來自PSⅠ。以上結果說明4株真眼點藻的熒光發射均沒有高等植物PSⅠ730nm處的熒光特征峰，預示著其光系統的結構和能量傳遞與高等植物存在一定差異。圖4為4株真眼點藻的低溫熒光激發光譜。424nm、442nm的熒光峰來源于Chla，470nm、483nm、496nm、518nm和525nm的熒光峰均來源于類胡蘿卜素，從熒光激發光譜可以看出Chla和類胡蘿卜素之間具有能量偶聯。以696nm和700nm為發射波長時，熒光激發光譜在480～550nm的波段處不同藻間出現的差異反映出4株真眼點藻PSⅡ色素蛋白復合物存在一定的差異。
2.54株真眼點藻的光合放氧及呼吸效率圖5(a)為4株真眼點藻不同生長階段最大光合速率變化。4株藻在不同生長階段最大光合速率先上升后下降，在第6dN.oculata的最大光合速率為59.62μmolO2•mg－1Chla•h－1，顯著高于其他3株藻(P＜0.05)，其余3株藻之間并無顯著性差異(P＞0.05)。圖5(b)為4株真眼點藻不同生長階段呼吸速率變化。4株藻的呼吸速率呈現上升趨勢。在第21d，N.oculata的最大呼吸速率為54.23μmolO2•mg－1Chla•h－1，顯著高于其他3株藻(P＜0.05)，其余3株藻之間并無顯著性差異(P＞0.05)。
3討論
Chla和類胡蘿卜素是真眼點藻主要的光合色素。本實驗測定4株真眼點藻均只含有Chla和3種主要的類胡蘿卜素而黃藻綱中含有Chla、葉綠素c、β－car和葉黃素等，因此，與黃藻綱相比，真眼點藻的色素組成是其分類的重要特征之一。N.oculata在培養過程中β－car含量下降，與前人對6種來自海水的真眼點藻的測定結果一致，但與本實驗的其他3株真眼點藻相反，表明來自不同生境的真眼點藻色素含量變化存在差異。本研究中4株藻在450－500nm波段的吸收峰為類胡蘿卜素，前人對其他真眼點藻的研究中也檢測到相似的吸收峰，這也是真眼點藻吸收光譜的特征之一。77K溫度下藻細胞只有光能傳遞的物理過程，所以77K低溫熒光光譜能直觀反應能量在PSⅡ和PSⅠ之間的傳遞和分配。本研究中E.sp.、V.helvetica和E.polyphem的低溫熒光發射光譜與JeanChrystal等人研究的Nannochloropsissalina相似，均有2個峰，而N.oculata則與WafaArsalane和JeanChrystal的Vischeriapunctata和N.sp.相似，只有1個發射峰，由此可見來自不同科屬和生境的真眼點藻在PSⅡ和PSⅠ之間的能量傳遞和分配存在差異性。本實驗結果表明，4株真眼點藻均沒有高等植物PSⅠ730nm處的熒光特征熒光峰，這與硅藻和綠藻等大多數藻類的情況相同，這也預示著4株真眼點藻在光系統的結構和能量傳遞方面與高等植物不同。多數藻類的PSⅠ沒有F730熒光，是因為藻類適應以黃綠光為主的弱光環境。
本研究表明，Chla和類胡蘿卜素之間具有能量偶聯，該結果與前人的研究結果一致，他們還證實在490nm附近的激發峰主要為Vio，Vio直接作用于PSⅡ從而推動光合作用的發生。本實驗中，4株真眼點藻的熒光激發光譜在480～550nm的波段處出現差異，反映出真眼點藻PSⅡ色素蛋白復合物組成上存在一定差異。隨著培養時間延長，培養基內營養鹽逐漸消耗，導致藻細胞內有機大分子(如:葉綠素)合成受阻，從而使藻細胞的生長代謝和光合速率受到影響。呂秀平等人的實驗表明，光合作用參數的變化很大程度上是由胞內Chla質量濃度變化所引起的，這與本實驗結果一致，N.oculata細胞內Chla的含量較高，所以其最大光合速率也明顯的高于其余3株藻。而徐芳等人測得N.sp.在對數期的最大光合速率為172.28±5.87μmolO2•mg－1Chla•h－1，呼吸速率為30.14±8.7μmolO2•mg－1Chla•h－1，這與本實驗對4株真眼點藻的研究結果不同，可能與實驗的條件以及真眼點藻的種類有關。海水的光照、溫度和滲透壓等環境異于淡水和土壤，本實驗中來自海水的N.oculata在生長代謝和光合生理上都與其他3株來自淡水和土壤的真眼點藻有顯著性的差異，這是他們長期適應生存環境的結果。本研究全面探討了4株真眼點藻的生長和光合生理特性，進一步證實其與黃藻綱和高等植物之間的差異，為研究真眼點藻光合作用機理及其代謝機制奠定理論基礎。
作者：王元麗李其雨李愛芬張成武單位：暨南大學水生生物研究中心生態學系