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《生物技術雜志》2014年第二期

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗材料脹果甘草(GlycyrrhizainflataBatal.)愈傷組織由為作者實驗室誘導并繼代保存;含有綠色熒光蛋白(GFP)基因的植物表達載體pBI121－gfp質粒由河北大學生命科學學院曲占良老師饋贈;根癌農桿菌EHA105和LBA4404菌株由中國農業大學于靜娟教授饋贈。

1.1.2試劑DM2000marker，日本Takara公司;oligodT15primer(10μmol/L)，美國Promega公司;dNTPs(各2.5mmol/L)，日本Takara公司;6×LoadingBuffer，Takara公司贈;瓊脂糖，北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3儀器設備BINTA2020D凝膠成像分析儀，北京賓達英創科技有限公司;HYA恒溫搖床，中國科學院武漢科學儀器廠;DYY－Ⅲ－6B型穩壓穩流電泳儀，北京六一儀器廠;DHP－2000型電熱恒溫培養箱，天津市華北實驗儀器有限公司;SANYOMDF－192型臥式超低溫冰箱，日本三洋公司;DXZ25－370型低溫冰箱，北京醫用低溫設備總廠。

1.1.4培養基

1.1.4.1MS基本培養基:MS微量元素，MS大量元素，MS鐵鹽，MS有機成分，蔗糖30g/L，固體培養基另加瓊脂8g/L，pH5.8。

1.1.4.2LB培養基:酵母粉5g/L;蛋白胨10g/L;NaCl10g/L;固體培養基另加瓊脂15g/L，pH7。

1.1.4.3YEB培養基:酵母浸膏1g/L;蛋白胨5g/L;牛肉膏5g/L;MgSO4•7H2O4g/L;蔗糖5g/L;固體培養基另加瓊脂15g/L，pH7。

1.2方法

1.2.1愈傷組織的繼代培養挑選結構疏松、顏色淡黃，生長狀況良好的脹果甘草愈傷組織轉入繼代培養基25℃，暗處進行繼代培養，繼代培養基為MS基本培養基+KT0.5mg/l+2，4－D1.0mg/l，每4w繼代1次［4］。

1.2.2抗性愈傷組織的篩選和檢測共培養后的愈傷組織轉入篩選培養基進行篩選，在篩選培養基上篩選45d后，統計愈傷組織轉化率。以共培養3d后的愈傷組織塊數為總塊數，45d后篩選平板上仍然能夠繼續生長，并且結構疏松，顏色淡黃的愈傷組織為抗性愈傷組織，統計并計算結果。轉化率=抗性愈傷組織塊數/總塊數×100%。篩選培養基為MS繼代培養基+Kan100mg/l+Cb500mg/l。篩選中愈傷組織每兩周換一次新鮮培養基。共培養完成后及篩選培養轉化愈傷組織時，分別挑取少量愈傷組織在OLYMPUSBX53熒光顯微鏡下用于470nm波長藍光觀察綠色熒光，以檢測綠色熒光蛋白在植物細胞中的表達情況。

1.2.3根癌農桿菌的轉化取含有植物表達載體pBI121－gfp質粒的DH5α菌株于LB培養基中37℃、200r/min過夜培養。取過夜培養的菌液于新鮮培養基，培養至OD600=0.6時，收集菌體提取質粒。利用改良的熱激法轉化農桿菌EHA105和LBA4404兩種菌株的感受態細胞，轉化后在YEB+Kan100mg/l+Rif125mg/l抗性平板上篩選重組菌。得到含有pBI121－gfp質粒的兩種重組農桿菌可直接活化用于植物細胞轉化或用終濃度為20%的甘油保存在－80℃冰箱中，備用。

1.2.4根癌農桿菌介導的甘草愈傷組織轉化挑取含有植物表達載體pBI121－gfp質粒的EHA105和LBA4404菌株的單菌落接種于YEB+Kan100mg/l+Rif125mg/l培養基中，28℃、180r/min過夜培養活化菌體。取1ml菌液至5ml新鮮培養基中，培養至OD600=0.6時，4000r/min離心5min收集菌體，用MS鹽溶液(pH7.0)重懸后，侵染甘草愈傷組織。分別取繼代培養3d、7d、10d、15d的愈傷組織置于重懸菌液中侵染15min;取繼代培養7d的材料設定10min、15min、20min等不同侵染時間;侵染后的愈傷組織用無菌濾紙吸干表面多余菌液后接種于鋪有無菌濾紙的MS基本培養基上，25℃黑暗條件下共培養3d。

1.2.5PCR分析質粒DNA的少量制備采用堿裂解法;轉化愈傷組織基因組DNA提取采用CTAB法。擴增gfp基因使用的引物為:正向引物:5’－CCGCCGAGGCATGAGTAAAG－3’;反向引物:5’－GCCATCGCCAATTGGAGTAT－3’。預期擴增產物大小為500bp的片段。擴增反應程序:熱啟動94℃3min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸50s，共30個循環。最后72℃延伸3min，終止反應。反應產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結果與分析

2.1抗生素敏感性試驗

為了篩選出轉化后的抗性愈傷組織，首先要對未轉化的甘草愈傷組織進行抗生素敏感性試驗，以確定合適的抗生素篩選濃度。選顏色淡黃、結構疏松、分散性好的愈傷組織，分散成體積大約為0.5cm2的小塊接種在分別含有0、25、50、100、125mg/l等不同濃度Kan的繼代培養基上，每個濃度做3個平行。分別在繼代培養0d、15d、45d測定愈傷組織鮮重，并計算其相對生長量。結果見表1，愈傷組織的生長速度隨著抗生素濃度的升高而越來越緩慢且相對生長量降低。如果繼續培養愈傷組織會逐漸失水皺縮，褐化死亡，在Kan濃度為125mg/l時，相對生長量達到最低。考慮到篩選抗生素濃度為Kan125mg/l時，可能會對轉化后的抗性愈傷組織的生長產生抑制，并且Kan100mg/l已經對未轉化甘草愈傷組織的生長具有較理想的抑制效果，因此選擇Kan100mg/l作為轉化后的抗性愈傷組織的抗生素篩選濃度。

2.2根癌農桿菌介導綠色熒光蛋白基因導入甘草愈傷組織

2.2.1轉化體系建立及轉化愈傷組織的綠色熒光蛋白(GFP)熒光檢測選擇EHA105和LBA4404兩種根癌農桿菌菌株，熱激法轉入含有綠色熒光蛋白GFP基因的植物表達載體pBI121－gfp，挑選轉化的農桿菌用于侵染脹果甘草愈傷組織。設置不同繼代培養時間的愈傷組織和農桿菌不同侵染時間兩組條件，經共培養3d后的甘草愈傷組織置于熒光顯微鏡下觀察。470nm藍光激發，愈傷組織細胞中明顯可見綠色熒光產生，而在未經農桿菌侵染的愈傷組織以及用不含植物表達載體的農桿菌侵染的愈傷組織細胞中均未見綠色熒光產生，圖1為共培養3d時的檢測結果。經過篩選培養基中篩選45d，獲得了具有卡那霉素抗性的愈傷組織，對抗性愈傷組織進行熒光檢測同樣可見綠色熒光產生(圖略)，說明抗性愈傷組織中表達了綠色熒光蛋白基因。

2.2.2轉化愈傷組織細胞gfp基因的PCR檢測選取篩選培養45d時在篩選平板上能繼續生長的抗性甘草愈傷組織，提取基因組DNA用PCR方法擴增gfp基因，瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示在轉化的愈傷組織中擴增出了預期的500bp的gfp片段，而在未轉化愈傷組織中未擴增出此片段，圖2顯示了部分抗性愈傷組織的檢測結果。PCR結果證明在抗性愈傷組織中gfp基因整合到了植物基因組中，也表明GFP熒光檢測與PCR擴增在gfp驗證結果一致。試驗結果表明，以農桿菌浸染脹果甘草愈傷組織共培養3d后，用含有100mg/L卡那霉素的愈傷組織繼代培養基篩選45d后，可以獲得gfp基因整合到甘草細胞基因組中的轉化愈傷組織，并且表達出了綠色熒光蛋白。

2.3不同因素對甘草愈傷組織遺傳轉化效率的影響

2.3.1受體材料繼代培養時間的影響用LBA4404－gfp和EHA105－gfp分別侵染繼代培養時間為3d、7d、10d、15d的愈傷組織各15min，共培養3d，100mg/lKan篩選，45d后統計結果并計算甘草愈傷組織的轉化率。如表2，表明LBA4404－gfp和EHA105－gfp均對繼代培養7d的愈傷組織轉化效率最高，LBA4404－gfp菌株的轉化率在3d、7d、10d、15d時，均低于EHA105－gfp。EHA105－gfp的轉化率在繼代培養時間為7d時最高，達到96%。

2.3.2不同侵染時間的影響取繼代培養7d的愈傷組織，LBA4404－gfp菌株和EHA105－gfp分別侵染愈傷組織10min、15min、20min，共培養3d后，100mg/lKan篩選，45d后統計轉化率。同時以不含pBI121－gfp質粒的農桿菌LBA4404和EHA105菌株分別侵染培養7d愈傷組織做為陰性對照。LBA4404－gfp和EHA105－gfp侵染愈傷組織材料，在侵染時間為10min，15min，20min時，統計結果見表2、3，兩種菌株都是在侵染時間為15min時，轉化率最高。并且侵染時間為15min時的轉化率高于10min，侵染時間為10min時的轉化率高于20min。因此15min是最佳侵染時間。

2.3.3不同菌株的影響通過使用不同預培養時間的受體愈傷組織和農桿菌不同侵染時間兩種實驗條件，轉化甘草愈傷組織后，轉化愈傷組織的抗性篩選實驗結果如表2、表3，表明EHA105－gfp菌株的轉化率高于LBA4404－gfp菌株。但是，EHA105－gfp侵染后的愈傷組織，農桿菌生長旺盛，很難除去，影響愈傷組織生長，所以在轉入篩選培養基之前，用附加500mg/lCb的無菌水清洗三遍，可以除去多余的EHA105－gfp。以上結果表明，對于根癌農桿菌介導的脹果甘草愈傷組織遺傳轉化，選擇繼代培養7d的愈傷組織作為受體材料，用EHA105－gfp侵染15min，共培養3d后用含有100mg/lKan的繼代培養基進行篩選，45d后可以獲得具有Kan抗性的轉化愈傷組織細胞，轉化效率可達97.14%。

3討論

目前，對甘草的研究主要集中在植株的有效藥用成分方面，對甘草愈傷組織次生代謝的基因工程調控研究和利用尚少。程煥欣等研究表明甘草愈傷組織有效成分(如黃酮類化合物)的含量較野生型高，所以通過組織培養技術獲得大量愈傷組織，并對其加以開發利用，將成為有效緩解甘草資源日益枯竭等問題的有效途徑。通過基因工程的手段，唐克軒課題組顯著提高了顛茄毛狀根莨菪烷類生物堿的合成效率和產物的積累;通過采用一系列的轉基因調控方法，美國加利福尼亞大學伯克利分校的JayD.Keasling等利用酵母合成了產量超過100mg/l的青蒿素前體物質———青蒿酸，為進一步降低抗瘧藥物的成本提供了希望。基因工程手段已日益成為調控次生代謝的有效途徑。范洪瓊通過誘導何首烏愈傷組織，得到高大黃素，大黃酸的細胞系;馬貴香等通過對黃芩愈傷組織培養過程中添加不同的外源激素，探索了外源激素對黃芩愈傷組織中黃芩含量的影響。雖然愈傷組織在研究植物次生代謝途徑方面也扮演著重要角色，但是運用基因工程的手段通過愈傷組織來進一步研究植物次生代謝的機理仍然存在著大片空白。王康濟構建了棉花遺傳轉化體系并實現了AtABA2基因的轉化，為甘草愈傷組織的遺傳轉化提供了借鑒。因此，把基因工程手段應用于甘草愈傷組織的研究，可以對其主要藥用次生代謝基因進行相應的調控和改良，擴大其利用空間，提高其利用價值。本研究建立了根癌農桿菌介導的甘草愈傷組織的遺傳轉化體系，為目的基因的導入，利用基因工程手段調控甘草次生代謝產物生物合成的研究奠定了基礎。

作者：陳子龍梁玉玲鮮于梁艷韋閱單位：河北大學生命科學學院河北省生物工程技術研究中心