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《中國生物防治學(xué)報(bào)》2016年第三期

摘要:

在華北地區(qū)棗園中，發(fā)現(xiàn)了綠盲蝽的一種卵寄生蜂，形態(tài)鑒定為盲蝽黑卵蜂Telenomussp.。直接觀察寄生蜂羽化情況表明，綠盲蝽越冬卵中盲蝽黑卵蜂的寄生率為0.67%～1.25%。設(shè)計(jì)了盲蝽黑卵蜂的特異性引物，對(duì)綠盲蝽越冬卵的分子檢測顯示，寄生率為13.04%～23.91%。與直接觀察方法相比，分子檢測技術(shù)能更加準(zhǔn)確地評(píng)估盲蝽黑卵蜂對(duì)綠盲蝽卵的寄生作用。

關(guān)鍵詞：

綠盲蝽；盲蝽黑卵蜂；棗園；越冬卵；寄生作用

綠盲蝽Apolyguslucorum（Meyer-Dür）是當(dāng)前我國棉花、棗、梨、葡萄等多種農(nóng)作物生產(chǎn)中的一種重要害蟲[1-3]。綠盲蝽成蟲和若蟲均能以口針刺吸為害寄主植物的幼嫩組織，導(dǎo)致葉片破損、落蕾落花、果實(shí)畸形等，對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響[4,5]。我國系統(tǒng)開展了綠盲蝽天敵資源的調(diào)查研究[6,7]，其中優(yōu)勢若蟲寄生蜂——紅頸常室繭蜂PeristenusspretusChenetvanAchterberg已實(shí)現(xiàn)人工規(guī)模飼養(yǎng)與田間釋放應(yīng)用[8,9]。綠盲蝽的卵常產(chǎn)在植物組織中，僅留卵蓋在植物表面，卵蓋長不足1mm，顏色較淺，肉眼難于發(fā)現(xiàn)；同時(shí)，卵多為散產(chǎn)[4]。這一習(xí)性使得綠盲蝽卵難于收集與觀察，限制了對(duì)其卵寄生蜂的研究。1958年，朱弘復(fù)和孟祥玲[10]記載了盲蝽的3種卵寄生蜂：點(diǎn)脈纓小蜂Anagrussp.、盲蝽黑卵蜂Telenomussp.和柄纓小蜂Polynemasp.，但由于綠盲蝽卵收集難而未對(duì)其田間寄生率進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查。研究發(fā)現(xiàn)，秋季綠盲蝽末代成蟲偏好在果樹枝條修剪殘茬等部位上產(chǎn)卵，越冬卵分布相對(duì)集中[5,11]，這為綠盲蝽卵寄生蜂的種類調(diào)查等研究提供了可能。本文對(duì)華北地區(qū)棗園中綠盲蝽卵寄生蜂種類進(jìn)行了調(diào)查，并利用直接觀察和特異性引物檢測2種方法評(píng)估了寄生蜂對(duì)綠盲蝽越冬卵的寄生情況。

1材料與方法

1.1室內(nèi)觀察2011、2013、2014和2015年的4月初，在綠盲蝽越冬卵孵化之前，從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊科研中試基地（河北廊坊，39.53ºN，116.70ºE）周邊的棗園中剪取棗樹斷枝。棗園面積約為3hm2，棗樹品種為“金絲小棗”，樹齡為5年，樹高3m。在棗園隨機(jī)剪取棗樹斷枝，帶回室內(nèi)在顯微鏡下，用昆蟲針將斷枝茬口的綠盲蝽越冬卵逐一挑出，將完好的卵放入底部鋪有一層吸水紙的培養(yǎng)皿（直徑為9cm）中，加入一個(gè)濕潤棉球進(jìn)行保濕，然后將培養(yǎng)皿蓋好后放置于25℃、RH65%、光周期14L:10D的培養(yǎng)箱中，逐日觀察與記錄寄生蜂的羽化情況。將羽化后的寄生蜂保存在75%的乙醇中，用于形態(tài)鑒定。

1.2分子檢測

1.2.1供試蟲源綠盲蝽采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊科研中試基地棉田，用新鮮的四季豆PhaseolusvulgarisL.豆莢在室內(nèi)進(jìn)行繼代飼養(yǎng)[12]。用于寄生蜂引物特異性檢測的非靶標(biāo)昆蟲中黑盲蝽Adelphocorissuturalis（Jakovlev）、苜蓿盲蝽Adelphocorislineolatus（Goeze）、三點(diǎn)盲蝽Adelphocorisfasciaticollis（Reuter）和牧草盲蝽LyguspratensisL.同樣為實(shí)驗(yàn)室種群。棗樹ZiziphusjujubeMill.、葡萄樹VitisviniferaL.枝條均采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊科研中試基地周邊果園。供試?yán)ハx取樣前，先饑餓24h，以去除腹部殘留食物。植物枝條用清水沖洗干凈后，于20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2DNA提取提取昆蟲基因組DNA前，將單頭昆蟲于清水浸泡12h，去除可能存留于體表的雜質(zhì)。之后將蟲體轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，用研磨棒將其磨碎，按照TIANampGenomicDNAKit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）說明書單頭提取綠盲蝽及非靶標(biāo)昆蟲的DNA，試劑購自天根生物（北京）有限公司。將剪碎的1g植物組織放入研缽中，加入液氮用研磨棒磨碎，用DNAsecureplantkit新型植物基因組DNA提取試劑盒購自天根生物（北京）有限公司，進(jìn)行DNA提取。

1.2.3引物設(shè)計(jì)先用COI通用引物（LepF1：5′ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG3′和LepR1：5′TAAACTTCGGATGTCCAAAAAATCA3′）擴(kuò)增綠盲蝽卵寄生蜂COI序列，測序后根據(jù)物種間不同堿基位點(diǎn)設(shè)計(jì)并獲得寄生蜂的引物。PCR擴(kuò)增總體系為20μL，包括0.4μLdNTPs（2.5mmol/L），2.0μLEasyTaqbuffer（10×），0.4μL正向引物（10μmol/L），0.4μL反向引物（10μmol/L），0.2μLEasyTaqDNA酶，15.6μLddH2O和1.0μLDNA模板。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，45℃退火30s，72℃延伸30s，共5個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10min。

1.2.4引物特異性檢測以常見盲蝽（綠盲蝽、中黑盲蝽、苜蓿盲蝽、三點(diǎn)盲蝽、牧草盲蝽）[13]和綠盲蝽的主要越冬寄主（棗樹、葡萄樹）[14]作為非目標(biāo)物種模板，以待測的綠盲蝽卵寄生蜂作為陽性對(duì)照模板，清水作為陰性對(duì)照，應(yīng)用上述所設(shè)計(jì)的引物對(duì)以上模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測該對(duì)引物的特異性。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.5引物靈敏度檢測以綠盲蝽卵寄生蜂DNA提取液為母液，進(jìn)行2倍梯度稀釋，應(yīng)用篩選到的特異性引物和1.2.4所述程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，直到稀釋液模板未能檢測到目的條帶為止。

1.2.6卵寄生情況檢測2014和2015年的4月初，分別于河北廊坊、山東沾化（37.69ºN，118.12ºE）的棗園中隨機(jī)采集棗樹枝條，在顯微鏡下觀察并收集綠盲蝽越冬卵。沾化棗樹品種為“冬棗”，樹齡為6年，樹高2m。提取單粒卵基因組DNA，應(yīng)用上述特異性引物檢測寄生蜂對(duì)綠盲蝽越冬卵的寄生情況。

2結(jié)果與分析

2.1室內(nèi)飼養(yǎng)寄生率2011年以及2013—2015年，從河北廊坊的棗園中分別采集綠盲蝽越冬卵6000、9500、5800與400粒，其中寄生蜂寄生率依次為0.67%、1.14%、0.72%與1.25%，4年平均寄生率為0.90%（表1）。經(jīng)形態(tài)鑒定，調(diào)查發(fā)現(xiàn)的寄生蜂為盲蝽黑卵蜂Telenomussp。

2.2分子檢測寄生率

2.2.1引物特異性檢測以綠盲蝽、中黑盲蝽、苜蓿盲蝽、三點(diǎn)盲蝽、牧草盲蝽以及棗樹、葡萄樹等非目標(biāo)物種模板為對(duì)照，檢測引物TeF1/TeR1的物種特異性。結(jié)果表明，該引物僅對(duì)盲蝽黑卵蜂具有擴(kuò)增能力，擴(kuò)增片段為225bp，片段單一且清晰，對(duì)非目標(biāo)物種不具有擴(kuò)增能力，證明該引物具有很強(qiáng)的特異性（圖1）。

2.2.2引物靈敏度檢測對(duì)特異性引物TeF1/TeR1做最低檢出限檢測，以梯度稀釋后的盲蝽黑卵蜂DNA（初始濃度為9.80ng/μL）為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。檢測結(jié)果顯示，該引物具有較高的靈敏度，最低檢出限如泳道5所示為0.61ng/μL（圖2）。

2.2.3寄生率檢測對(duì)河北廊坊、山東沾化棗園中綠盲蝽越冬卵進(jìn)行寄生率的檢測，結(jié)果顯示，盲蝽黑卵蜂對(duì)綠盲蝽越冬卵具有較強(qiáng)寄生能力。2014年，河北廊坊綠盲蝽越冬卵的寄生率為23.91%；2014年和2015年，山東沾化地區(qū)棗園綠盲蝽越冬卵寄生率分別為13.04%和20.73%（表2）。

3討論

物種特異性引物檢測技術(shù)是一種基于PCR的快速檢測方法，近年來發(fā)展迅速，已成為害蟲與天敵寄生關(guān)系研究及其寄生率評(píng)估的重要手段[15-18]。Agusti等[19]發(fā)展了湯普森厲寄蠅Lydellathompsoni（Herting）和稻苞蟲賽寄蠅Pseudoperichaetanigrolineat（aWalker）的COI特異性引物，檢測其對(duì)玉米上玉米螟Ostrinianubilali（sHübner）滯育幼蟲的寄生情況，發(fā)現(xiàn)二者對(duì)玉米螟的寄生率均較低，分別為2.16%和2.83%。Traugott等[20]設(shè)計(jì)了半閉彎尾姬蜂DiadegmasemiclausumHellen、粉蝶盤絨繭蜂Cotesiaglomerata（L.）和微紅盤絨繭蜂Cotesiarubecula（Marshall）的COI特異性引物及其多重PCR檢測體系，對(duì)結(jié)球甘藍(lán)有機(jī)種植園中3種害蟲進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，半閉彎尾姬蜂對(duì)小菜蛾P(guān)lutellaxylostella（L.）的寄生率為33.4%；粉蝶盤絨繭蜂對(duì)歐洲粉蝶Pierisbrassicae（L.）、微紅盤絨繭蜂對(duì)菜青蟲Pierisrapae（L.）的寄生率分別為52%和53.4%。

本研究設(shè)計(jì)了盲蝽黑卵蜂的COI特異性引物，檢測發(fā)現(xiàn)在棗園中對(duì)綠盲蝽越冬卵的寄生率在13.04%～23.91%，表明該寄生蜂對(duì)綠盲蝽卵具有較強(qiáng)的控制作用。發(fā)展的盲蝽黑卵蜂分子檢測技術(shù)能有效克服盲蝽卵小、其寄生蜂研究難的問題，有助于后續(xù)開展不同季節(jié)綠盲蝽卵寄生率的系統(tǒng)調(diào)查。盲蝽黑卵蜂COI特異性引物對(duì)中黑盲蝽、苜蓿盲蝽、三點(diǎn)盲蝽、牧草盲蝽以及葡萄樹同樣不具擴(kuò)增能力，具有特異性，為下一步評(píng)價(jià)盲蝽黑卵蜂對(duì)上述盲蝽種類的寄生作用、以及在葡萄園的控害功能奠定了基礎(chǔ)。在昆蟲寄生作用的評(píng)估中，分子檢測結(jié)果與直接觀察法所得結(jié)果常相差較大。如Ashfaq等[21]檢測紫花苜蓿地中的淡足常室繭蜂Peristenuspallipes（Curtis）對(duì)盲蝽的寄生作用，其中90%以上為Lygusborealis（Kelton）所寄生，常規(guī)飼養(yǎng)法測得2001年和2002年的羽化率分別為29%和21%，遠(yuǎn)小于PCR檢測的寄生率78%和64%。這主要因?yàn)橛鸹试u(píng)估中忽視了寄生蜂未成功發(fā)育羽化的情況，會(huì)低估寄生效率。同時(shí)，和直接觀察法相比，PCR檢測技術(shù)甚至可以檢測到處于卵期的寄生蜂[22]。

本研究中盲蝽黑卵蜂飼養(yǎng)寄生率不足2%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PCR檢測所得的寄生率。在1個(gè)多月的直接觀察過程中，我們發(fā)現(xiàn)大量越冬卵因失水干癟、被微生物寄生等原因而死亡，既不出蜂也不孵化，這是導(dǎo)致上述結(jié)果差異的主要原因。綜合上述分析，PCR檢測技術(shù)可以更加準(zhǔn)確有效地評(píng)估寄生蜂的寄生能力，同時(shí)極大地縮短了寄生率檢測時(shí)間。本研究首次探究寄生蜂對(duì)綠盲蝽卵的控制能力，為生產(chǎn)上這種天敵的挖掘利用提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為優(yōu)化綠盲蝽防治技術(shù)提供新思路。

作者：李金花 潘洪生 楊帆 羅淑萍 袁海濱 陸宴輝 單位：天津科技大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院