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《生物工程學報雜志》2014年第六期

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種和質粒大腸桿菌DH5α為本實驗室保存；宿主菌畢赤酵母GS115、質粒pPICZαA購自Invitrogen公司。

1.1.2試劑及儀器擬南芥ArabidopsisthalianacDNA為山東大學微生物國家重點實驗室所贈；Taq酶、DNA連接酶、限制酶均購自大連寶生物公司；DNA柱純化試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司；DNA及蛋白標準分子量、質粒提取試劑盒以及T載體購于北京全式金公司；LB培養基、YPD培養基均按照Invitrogen公司畢赤酵母表達手冊配制；其他試劑為國產和進口分析純試劑。所用儀器：2720ThermalCyclerPCR儀；國產DYY-12電泳儀；Bio-RadGenePulserⅡ電轉化儀；島津GCMS-QP2010氣質聯用儀。

1.1.3引物據擬南芥硫酯酶基因AtFatA(GenBank:AK176105)設計引物，上游、下游引物分別命名為P1、P2，并分別引入EcoRⅠ、XbaⅠ酶切位點(下劃線)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)。

1.2方法

1.2.1PCR反應獲取目的片段以擬南芥的cDNA作為模板，進行PCR擴增。反應條件：94℃5min；94℃30s；57℃30s；72℃2min；30個循環；最后72℃延伸10min。反應結束后以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產物并進行柱回收。

1.2.2構建重組T載體pEASY-Blunt-AtFatA將T載體及上述PCR反應所得基因產物分別進行EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切反應，膠回收基因片段和相同酶切的T載體，按照一定比例連接得到重組T載體后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，并將其涂布于含有30µg/mLZeocin抗性平板，37℃恒溫箱隔夜培養，藍白斑篩選，用滅菌牙簽挑取抗性單克隆菌落，分別以P1、P2作上、下游引物，進行菌落PCR初步驗證。 按對應序號在同濃度Zeocin抗性低鹽LB培養基中擴培，提取重組T載體，酶切二次鑒定，然后將通過驗證的重組T載體送至上海生工測序最終驗證。

1.2.3重組質粒pPICZαA-AtFatA的構建搖菌并提取、純化重組T載體、pPICZaA質粒，對二者分別進行EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切反應，膠回收AtFatA基因片段和相同酶切的pPICZαA質粒，按照一定比例連接得到重組質粒后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞(圖1)，然后按照1.2.2中重組T載體的操作方法對其進行抗性篩選；37℃隔夜培養后見白色菌落。進一步對所構建的重組質粒pPICZαA-AtFatA進行如上重組T載體的三步驗證，確保重組質粒構建成功以及所攜目的基因的精確。

1.2.4重組質粒pPICZαA-AtFatA的轉化和鑒定將提純的pPICZαA-AtFatA質粒用SacⅠ限制酶單切線性化后，電擊轉化至畢赤酵母GS115感受態細胞，涂布于含有120µg/mLZeocin的YPDS平板，30℃培養4−6d，篩選到陽性轉化子。同濃度ZeocinYPD培養基擴培后提取重組菌的基因組，以P1和P2為引物進行PCR鑒定，同時以轉化過空載體的菌株作空白對照。

1.2.5外源蛋白的誘導表達與檢測挑取Mut+重組子，接種至含50mLBMGY培養基的500mL三角瓶中，30℃、250r/min振蕩培養20h；3000r/min離心5min，棄去上清，再以50mLBMMY重懸菌體；菌液置于500mL擋板瓶中，用四層紗布封口，28.5℃、250r/min振蕩培養，誘導表達；每24h向培養基中添加除菌的無水甲醇使其終濃度為0.5%，誘導72h，收集發酵物。取少量發酵產物離心，收集發酵上清液與發酵既得菌體。在緩沖液保護下將菌體破壁、3000r/min離心5min處理，保留上清。同時取野生菌進行相同發酵條件及后期處理，以作空白對照。用SDS-PAGE法分別對發酵上清液和破壁離心后菌體上清液進行蛋白檢測。

1.2.6胞外游離脂肪酸的檢測用氣質聯用法(GC-MS)檢測胞外游離脂肪酸種類及含量，進而間接評估外源硫酯酶蛋白活性。將1.2.5中的發酵上清液進行脂肪酸甲酯化處理，處理方法參考文獻[17]。GC-MS色譜條件：毛細管柱為DB-5MS，載氣為高純氦氣(99.999%)，進樣器溫度230℃，檢測器溫度250℃，載氣柱頭壓65.2kPa。程序升溫條件：初始溫度90℃，保持3.5min，5℃/min升至250℃，保持5min。分流比設定為1：30，每次進樣量為1μL。

2結果與分析

2.1目的基因擴增以擬南芥的cDNA作為模板，由PCR擴增得到約1200bp的目的片段，大小與擬南芥硫酯酶基因預測值相符，說明目的基因克隆成功。

2.2重組T載體及重組質粒的構建與鑒定硫酯酶基因擴增片段插入T載體、重組質粒。經菌落PCR及對提取重組T載體、重組質粒分別酶切驗證(重組質粒雙酶切驗證如圖2所示)，硫酯酶目標片段經DNA測序后，將測序結果與GenBank(AccessionNo.AK176105)序列進行比對分析，結果顯示PCR擴增所得基因片段序列與擬南芥FatA型脂酰-ACP硫酯酶目的基因序列相似度達到100%，未發生堿基突變或丟失，表明目標基因(AtFatA)擴增獲得成功。

2.3重組質粒的轉化將構建完成并測序無誤的重組質粒通過電轉化法整合到畢赤酵母GS115基因組中，從抗性平板上挑取陽性菌落，經YPD液體培養基搖瓶培養48h，提取酵母基因組，以P1，P2為引物進行PCR鑒定，證明陽性轉化子基因組為模板成功克隆出AtFatA基因，重組質粒整合進入畢赤酵母基因組，重組菌構建成功，命名為Pichiapastoris-AtFatA。digestionofrecombinantplasmidpPICZαA-AtFatA.

2.4外源蛋白的誘導表達與對照菌相比，整合有擬南芥硫酯酶基因的重組菌在陽性轉化子誘導表達后經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對胞外蛋白檢測，并未發現差異蛋白；但對胞內蛋白進行檢測時，發現重組菌多出一條大小約45kDa的蛋白(圖3中6、8泳道所示)，這與擬南芥硫酯酶預測的相對分子質量大小相符。這說明重組菌株表達的外源蛋白成功，但是并沒有直接將外源蛋白分泌至胞外，而是以胞內蛋白形式存在。比對胞內外蛋白電泳圖，分析認為目的蛋白沒有分泌至胞外的原因可能有以下兩點：一是目的蛋白分泌到胞外后被胞外的蛋白酶所降解。從圖3的1−4泳道中可以看到胞外確實存在微量非目的蛋白(約38kDa處)的蛋白條帶，說明了蛋白酶存在的可能性。相同條件下重新搖瓶發酵，發酵液中添加蛋白酶抑制劑以作對照。發酵結束后取對照組發酵上清液進行SDS-PAGE檢測仍得到完全一致的結果，未見目的蛋白條帶，這說明1−4泳道中的微量蛋白并非蛋白酶，排除蛋白酶干擾的可能性；二是目的蛋白沒有按照預期設計分泌到胞外，而是以胞內蛋白的形式存在。由于目的蛋白的分泌受外源基因的特性如基因密碼子組成，信號肽的準確表達與引導，目的蛋白分泌前在胞內相關細胞器上的正確修飾與傳送以及該目的蛋白本身的空間結構等多種因素影響，上述任一因素的干擾都可能會最終導致目的蛋白的分泌失敗[18-20]。

2.5胞外游離脂肪酸的檢測分別收集野生菌及重組菌的發酵上清液，對胞外游離脂肪酸進行甲酯化處理，并分別對兩組甲酯化產物進行GC-MS檢測，結果如圖4、5所示。分析對比該兩組相同檢測條件下的圖譜可知，重組菌與對照菌均主要含6種胞外游離脂肪酸，分別為辛酸(8：0)、月桂酸(12：0)、肉豆蔻酸(14：0)、棕櫚酸(16：0)、油酸(18：1)、硬脂酸(18：0)，這說明重組菌中AtFatA基因的表達并沒有改變菌體產生胞外游離脂肪酸的種類。與野生菌相比，重組菌Pichiapastoris-AtFatA生產胞外游離辛酸、月桂酸、豆蔻酸、棕櫚酸、油酸和硬脂酸的能力分別為野生菌的151%、110%、85.5%、68.2%、62.7%和75%。重組菌比野生菌胞外游離MCFAs(主要是辛酸)產量增加51%，MCFAs產量在胞外總游離脂肪酸產量中所占比例達到28.7%，高出野生菌10.6%。

3討論

實驗在宿主菌畢赤酵母GS115的基因組上插入外源AtFatA基因對其進行基因改造并成功表達，大幅度提高了胞外游離MCFAs的產量，使得直接從發酵液中方便地分離提取MCFAs成為可能，免去了破碎細胞提取發酵產物的繁瑣，節約生產成本，利于工業化生產。與外源硫酯酶的植物表達系統[21]相比，該表達系統的培養、轉化及高密度發酵等操作接近原核生物，表達系統簡單[16]，非常適合規模化生產；而與該外源酶的原核表達系統[22]相比，該真核表達系統則具有一定的蛋白質翻譯后加工能力，有利于真核蛋白的表達[16]，且該系統不產生內毒素，更適和用于食品及醫藥品的生產。值得一提的是外源AtFatA基因是以基因重組的方式整合到畢赤酵母的基因組上，故而外源基因在畢赤酵母中比較穩定，不會發生原核表達系統傳代過程中類似質粒丟失的現象[23]。畢赤酵母表達系統具有穩定、低毒、代謝可控以及適和規模發酵等諸多優點，該研究方法對指導生產食品及藥用MCFAs具有一定的積極意義。但我們認為要想將此技術運用到工業生產上還存在以下兩個問題：第一，該實驗只是通過搖瓶發酵的方式對該重組菌產MCFAs的性能進行了檢測，其生產MCFAs的能力雖較野生菌有一定程度提高，但要想進一步提高其產量，擴大到工業化生產，實現規模發酵還需摸索諸多條件，如該重組菌在發酵罐中產MCFAs的最適溫度、pH、及供氧量乃至最適發酵周期等，這些因素都將對發酵效率產生影響[24-26]；第二，如何從發酵液中安全、穩定、方便地分離或提取MCFAs的工藝尚需進一步摸索。在此分離或提取過程中應盡量不引入對人體有毒害作用的提取劑，從而確保生產出的MCFAs在食品及藥用等方面的安全性，又可減少產物后期處理中為除去引入的有毒提取劑而徒增的工藝流程，節約生產成本。相信隨著對巴斯德畢赤酵母研究和認識的進一步深入以及化工行業分離提取技術的蓬勃發展，上述的兩個問題短期內即可得到解決，屆時利用工程菌的代謝生產MCFAs亦會具有一定的應用前景。

作者：郝昭程王騰飛李忠奎郝梓凱戴琨王瑞明單位：齊魯工業大學食品與生物工程學院