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《生物工程學(xué)報(bào)雜志》2014年第六期

1材料與方法

1.1菌種和質(zhì)粒大腸桿菌XL10-Gold購(gòu)于Stratagen公司。畢赤酵母GS115購(gòu)于Invitrogen公司。畢赤酵母表達(dá)載體pHBM905A由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[9]。

1.2主要試劑限制性內(nèi)切酶NotⅠ、CpoⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ，SolutionⅠ連接套裝及DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)均購(gòu)于TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)于Axygen公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)于Fermentas公司；dNTPsMix購(gòu)自捷瑞公司；Pfu高保真聚合酶購(gòu)自東洋紡公司；所用PAGE純引物在上海桑尼生物工程公司合成；二肽N-芐氧羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸(Z-Phe-Leu)為武漢Bioyears公司合成；其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3Cpasetaq基因體外合成及表達(dá)載體pHBM905A-CpaseTaq的構(gòu)建通過(guò)NCBI查詢到該基因?qū)?yīng)的氨基酸序列(GenBankAccessionNo.P42663.2)，其下游額外添加6×His標(biāo)簽，總共517個(gè)氨基酸，利用DNAWorks3.2[10]依據(jù)密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)需要的引物(未列出)，采用兩步合成全基因的方法[11]合成上述基因。載體pHBM905A以NotⅠ、CpoⅠ雙酶切，目的基因經(jīng)T4DNA聚合酶處理后與載體連接[9]，陽(yáng)性克隆由上海桑尼生物工程公司測(cè)序并進(jìn)行序列分析。

1.4質(zhì)粒pHBM905A-CpaseTaq轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115測(cè)序正確的重組質(zhì)粒和空載體pHBM905A分別經(jīng)SalⅠ線性化，溶液回收后各得10μgDNA。將線性化的質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，涂布MD平板，培養(yǎng)60h后利用菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)化空載體pHBM905A的酵母菌作為負(fù)對(duì)照。

1.5畢赤酵母重組子誘導(dǎo)表達(dá)誘導(dǎo)表達(dá)方法參照Invitrogen畢赤酵母操作手冊(cè)。

1.6SDS-PAGE分析SDS-PAGE分析方法分別參照Bio-Rad實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。

1.7羧肽酶Taq純化將誘導(dǎo)72h后的培養(yǎng)基5000r/min離心10min，粗酶液經(jīng)截留分子量為30kDa超濾膜超濾處理，并用50mmol/LTris-HCl(100μmol/LZn2+，pH7.2)洗滌粗酶液，繼續(xù)超濾以除掉粗酶液中的培養(yǎng)基。親和層析柱用50mmol/LPBS(10mmol/L咪唑，pH7.2)洗滌10個(gè)柱體積，緩慢加入超濾后的酶液。酶液和層析柱在4℃孵育90min，棄去未結(jié)合上清，層析柱用50mmol/LPBS(20mmol/L咪唑，pH7.2)洗滌20個(gè)柱體積。目的蛋白以50mmol/LPBS(50、100、150、200、250、300、350、400mmol/L咪唑，pH7.2)分別洗脫。

1.8去糖基化處理羧肽酶的脫糖基化實(shí)驗(yàn)參照NEB公司操作說(shuō)明。1.9羧肽酶Taq酶活力測(cè)定及酶活力單位定義酶活測(cè)定參照Doi等的方法[12]，酶活測(cè)定以Z-Phe-Leu為底物，用50mmol/LTris-HCl(pH7.5)，70℃反應(yīng)15min，茚三酮作為顯色劑，測(cè)定復(fù)合物在505nm處的光吸收值。配制不同濃度的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活單位定義：每1min水解生成1μmol亮氨酸所需的酶量作為一個(gè)酶活力單位(U)。

2結(jié)果

2.1表達(dá)載體pHBM905A-CpaseTaq的構(gòu)建表達(dá)載體pHBM905A經(jīng)NotⅠ、CpoⅠ雙酶切，通過(guò)兩步法合成基因，將回收的基因片段(圖1A)連接到載體pHBM905A上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL10-Gold，轉(zhuǎn)化子以基因?qū)Ｒ恍砸镞M(jìn)行菌落PCR初篩，初篩質(zhì)粒再經(jīng)EcoRI、BamHI酶切，瓊脂糖凝膠電泳顯示出酶切后釋放出大小3000bp左右的DN段帶，與預(yù)期大小(3050bp)相符合，上述重組子(圖1B)經(jīng)上海桑尼生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果完全正確。

2.2畢赤酵母重組子鑒定及羧肽酶Taq誘導(dǎo)表達(dá)將鑒定正確的重組子搖瓶培養(yǎng)，每隔24h添加1%的甲醇作為誘導(dǎo)物，并同時(shí)取樣。取40μL粗酶液上清，加入8μL6×SDS-PAGE上樣緩沖液，于100℃煮沸10min，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)。結(jié)果顯示重組羧肽酶蛋白分子量與理論值(58.8kDa)相符(圖2)。通過(guò)蛋白質(zhì)定量分析表明，誘導(dǎo)72h后總蛋白量可達(dá)到最大值0.1mg/mL，酶活力測(cè)定顯示酵母發(fā)酵上清的酶活性為11.6U/mg，從第72h開(kāi)始，總蛋白開(kāi)始出現(xiàn)部分降解。

2.3羧肽酶Taq的純化及活性測(cè)定洗脫成分經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)顯示300mmol/L咪唑的PBS洗脫效果最好(圖3)。粗酶液超濾后的酶活性為59.4U/mg，親和層析純化完的酶活性為77.6U/mg(圖4)。經(jīng)軟件預(yù)測(cè)該蛋白不含潛在的糖基化位點(diǎn)，通過(guò)EndoH(29kDa)去糖基化處理該酶，也表明該蛋白沒(méi)有被明顯的糖基化(圖5)。

2.4酶學(xué)性質(zhì)分析酶活測(cè)定顯示，在50mmol/LTris-HCl(pH7.5)中，最適作用溫度為75℃(圖6A)，在50mmol/L不同pH的反應(yīng)緩沖液中，其最適作用pH為7.5(圖6B)。

3討論

動(dòng)物來(lái)源的羧肽酶基因經(jīng)常帶有前肽編碼序列[13-14]，異源表達(dá)都以酶原的形式存在，應(yīng)用的前提是體外激活[1]，這種非特異性激活往往不能賦予酶完整的活性[15]，給應(yīng)用帶來(lái)障礙。國(guó)外羧肽酶Taq之前僅有在大腸桿菌中表達(dá)的報(bào)道,純化極其繁瑣，工業(yè)應(yīng)用前景不強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)密碼子優(yōu)化，使羧肽酶Taq可以在畢赤酵母中有效大量地分泌表達(dá)。和傳統(tǒng)的羧肽酶相比，羧肽酶Taq分泌出酵母細(xì)胞外時(shí)，以成熟的形式存在，且具備高活性80U/mg。并且純化過(guò)程只需兩步操作，就可以獲得大量的高酶活羧肽酶Taq，這是大規(guī)模制備和生產(chǎn)羧肽酶Taq的基礎(chǔ)。酶學(xué)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，組氨酸標(biāo)簽融合的羧肽酶Taq最適pH和溫度與天然的酶有一定差別。天然酶的最適pH為8.0，最適溫度為80℃，本實(shí)驗(yàn)研究組氨酸標(biāo)簽融合重組酶的最適pH為7.5左右，最適溫度為75℃，在70℃以上，該酶保持較高活性。產(chǎn)生該差異的機(jī)制目前并不清楚，畢赤酵母表達(dá)的分泌蛋白往往容易發(fā)生N-糖基化，N-糖基化往往可以改變酶的某些生物學(xué)活性[16]，通過(guò)去N-糖基化處理發(fā)現(xiàn)畢赤酵母表達(dá)的羧肽酶Taq不帶有N-糖基化，然而是否是組氨酸標(biāo)簽影響了羧肽酶Taq最適作用pH和溫度仍然有待研究。由于羧肽酶水解能力差，作用底物范圍小，羧肽酶極少應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。而本研究中的重組羧肽酶Taq具有高酶活和廣泛的底物特異性等特點(diǎn)，有大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)酶法水解多肽的前景，但是該酵母工程菌在小肽水解方面的工業(yè)應(yīng)用值得我們更深入的探索。

作者：余先紅汪曉娟鐘星唐微翟超陳晚蘋(píng)馬立新單位：湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院湖北省工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物資源綠色轉(zhuǎn)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心湖北大學(xué)知行學(xué)院生物工程系