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1國內外海水養殖品種主要病害檢測方法

針對以上養殖魚種主要細菌性病害，各國研究人員為開發快速、準確、有效的診斷方法廣泛開展工作。筆者等將目前已報道的國內、國外主要海水養殖細菌性病害檢測方法總結為以下幾種類型進行敘述。

1.1基于微生物生理生化檢測的方法

針對養殖魚種細菌性病原的檢測，最經典的鑒定方法是對病原進行分離純化，基于形態學檢測、生理學和通過一系列的生理生化實驗實現對微生物的初步鑒定。然而，這種方法耗時長、操作繁瑣，不利于細菌性病害的快速診斷。法國生物梅里埃公司于1970年開發出一系列微生物鑒定用生理生化檢測試劑盒，使細菌鑒定更簡單快捷。該系列試劑盒已成為國際公認的鑒定細菌的參考標準，目前在海水養殖魚類細菌性病害的診斷中，已將API系列試紙條檢測結果作為鑒定的輔助手段之一。Abdel-Aziz等采用API20NE生理生化檢測試劑盒與分子鑒定相結合，對導致埃及沿海養殖金頭鯛和歐洲海鱸大量死亡的病原進行了鑒定，確定了溶藻弧菌、副溶血弧菌和美人魚發光桿菌殺魚亞種造成病害的主要病原。潘曉藝等根據API20E結果結合16SrDNA和gyrB基因序列比對，確定從發病養殖中華鱉肝臟分離得到的一株致病菌為遲鈍愛德華氏菌。除了API系列檢測試劑盒，針對一些特殊的細菌性病原還可以采取更為簡便的顯色培養技術[20]。該技術在培養基中加入細菌特異性酶的顯色底物，使菌落出現不同顏色而達到分離鑒定的目的，如硫檸膽蔗瓊脂（thiosulfatecitratebilesaltssucroseagar，TCBSagar）已經被廣泛用于霍亂弧菌和副溶血弧菌的分離鑒定。近年來還有很多新型顯色培養基被開發出來，如選擇性顯色弧菌培養基（vibrio-biochromemedium，BCVM），副溶血弧菌在其上生長形成的菌落呈紫色，而其他弧菌則呈藍綠色，可以更有效的將副溶血弧菌與其他致病性弧菌區分開來。目前這種方法不僅被廣泛用于人類病原菌的初步分離鑒定，也越來越多地被應用到水產養殖業病害檢測中。

1.2基于分子生物學技術的檢測方法

基于分子生物學技術的養殖魚類細菌性病害的檢測方法在已有報道文獻中占到50%以上，該方法與傳統的生理生化檢測方法相比簡潔、快速、靈敏度高、特異性強，可用于細菌性病害疾病的預警和診斷。

1.2.1聚合酶鏈反應技術聚合酶鏈反應或稱多聚酶鏈反應(polymerasechainreaction，PCR)，是根據生物信息學等方法尋找特定病原菌特異性基因序列設計特異性引物，擴增后產生特異性片段從而達到檢測病原菌的目的。目前多數文獻針對不同細菌性病害的特異性基因序列設計引物，建立了靈敏有效的檢測方法。Pinto等以toxR，tlh，tdh和trh作為目的基因實現了副溶血弧菌的檢測；Lee等以創傷弧菌溶血素為靶標，設計特異性引物建立其PCR檢測方法。隨著PCR技術的成熟，基于多種病菌的同時檢測的多重PCR技術逐漸發展起來。Kong等建立了一種以嗜水氣單胞菌的氣單胞菌溶素基因、弗氏志賀菌ipaH基因、鼠傷寒沙門氏菌ipaB基因、霍亂弧菌epsM基因和副溶血弧菌16S-23SrDNA為目標基因，設計六對擴增后可產生6種不同長度的片段的特異性引物來快速同時檢測水產品中這6種致病菌。此檢測方法可在12h內完成，檢測限可以達到100~102CFU/mL。

1.2.2環介導等溫擴增技術（loop-mediatedisother-malamplification，LAMP）由于傳統的PCR技術需要精確控制擴增反應各階段溫度，一定程度上限制了其在水產養殖業中的應用。Notomi等于2000年提出的一種只需在恒溫條件下就可以進行核酸擴增的LAMP技術。LAMP通過設計兩對特別的引物（內引物和外引物）在一種有鏈置換活性的DNA聚合酶作用下進行的一種自動鏈置換DNA合成反應。因為DNA在65℃左右處于動態平衡狀態，任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離成為單鏈，所以該技術在恒溫下就可以進行核酸擴增，已被用于多種水產養殖細菌性病害的檢測。Yeh等根據鯰魚愛德華氏菌eip18基因設計引物進行LAMP擴增，在65℃反應60min后可得到鯰魚愛德華氏菌基因特異性條帶，檢測限可達到20CFU/mL，可以從養殖水體樣本中實現鯰魚愛德華氏菌的檢出。Surasilp等將LAMP與橫向流動試紙條分析相結合，以rpoS基因為靶基因建立了一種LAMP-LFD方法來檢測創傷弧菌，對于純培養檢測限可達到1.5×103CFU/mL。

1.2.3實時定量PCR技術（quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qRT-PCR）qRT-PCR目前也被廣泛用于水產養殖病害的定量檢測。該技術特異性強、靈敏度高、重復性好，可同時檢測同一樣本中不同靶序列。Blackstone等以TaqMan探針為基礎，采用qRT-PCR技術以副溶血弧菌特異性tdh基因來檢測副溶血弧菌，檢測限可達到每PCR體系1CFU。Panicker等針對vvh基因設計寡核苷酸引物，建立了以SYBRGreenI染料為基礎的qRT-PCR快速、特異性地檢測牡蠣組織勻漿和墨西哥灣水體中的創傷弧菌。該方法對于純基因組DNA的最低檢測量為1pg，水體中檢測限可達10CFU/mL。許龍巖等根據副溶血弧菌toxR基因和tdh基因設計引物對副溶血弧菌建立了一種基于TaqMan探針的雙重熒光PCR檢測法。該方法具有良好的特異性，水體中常見非副溶血弧菌細菌均呈陰性，副溶血弧菌的菌濃度與Ct值的反向線性關系良好，檢測限為3.6×102CFU/mL。

1.2.4基因探針技術自1975年DNA探針雜交技術被首次提出，基因探針技術已得到了很大的進步和發展。該技術的基本依據是核酸雜交，針對決定病原菌生物體特性的DNA序列設計特異性標記的DNA或RNA探針，就可以通過樣品與探針雜交是否形成雜交分子來檢測是否存在目標病原菌。基因探針的標記方法主要有放射性標記法和非放射性標記法兩種。目前常用的標記物為堿性磷酸酶（AP）和地高辛（DIG）。該技術除用于人類病原診斷，也被用于水產養殖病原檢測中。周鳳麗等針對溶藻弧菌膠原蛋白酶基因和外膜蛋白基因設計了兩對引物對溶藻弧菌進行PCR擴增，對擴增產物以DIG標記制備基因探針用于檢測溶藻弧菌，發現膠原蛋白酶基因探針有較高特異性，可用于對溶藻弧菌的檢測鑒定分析。Raghunath等用AP來標記基因探針檢測海洋食品中的trh+副溶血弧菌，對40株副溶血弧菌、45株其他弧菌和55株非弧菌進行探針雜交，特異性達100%，檢測限達到5.0×102~3.4×103CFU/g。

1.3基于免疫學相關技術的檢測方法

除分子生物學技術外，免疫學相關技術也被廣泛用于水產養殖品種病害診斷。基于免疫學相關的檢測方法利用抗原抗體特異性結合的原理，目前應用較多的有酶聯免疫吸附法和免疫層析技術。

1.3.1酶聯免疫吸附法（enzyme-linkedimmuno-sorbentassay，ELISA）ELISA技術最早出現于1971年，該技術的基礎是抗原抗體特異性反應，常用的ELISA方法有競爭法測抗原、間接法測抗體和雙抗體夾心法，其特異性取決于抗體的特異性。Smith等最早將ELI-SA應用于魚癤病的診斷，靈敏度達102CFU/mL。Kumar等建立了快速檢測水產品中副溶血弧菌的ELISA方法。吳曉春等以魚腸道弧菌為抗原制備多克隆抗體，用ELISA法來檢測對海水魚造成危害的弧菌屬致病菌，靈敏度可達到每孔105CFU/mL。

1.3.2免疫層析技術傳統ELISA技術操作繁瑣、耗時長，限制了其在養殖場現場檢測中的應用。目前，研究工作者將免疫層析技術應用于快速檢測，如側向層析技術(lateral-flowtechnology，LFT)被用于快速檢測試紙條的研發。與傳統檢測方法相比，該檢測技術具有快速、簡便、價格低廉等優點。LFT的原理與ELISA相似，以固定了捕獲蛋白(通常為抗體或抗原)的硝酸纖維素膜作為基板，采用乳膠、膠體金、碳以及新型材料(上轉磷光或量子點)作為標記物對抗體或抗原進行標記，其檢測結果可以用肉眼直接觀測。目前已商業化用于診斷的免疫層析試紙產品大多為以納米級膠體金顆粒為標記材料。此技術操作簡便，一般5~15min就可得到結果，已廣泛用于藥殘檢測、食品安全、臨床診斷中，也有用于水產養殖品種病害檢測的報道。Sithigorngul等制備了抗哈維氏弧菌的鼠單克隆抗體和羊多克隆抗體，將這兩種抗體用于膠體金免疫層析試紙條的制備，結果表明樣品檢測量只需100μL，針對哈維氏弧菌的檢測限可達106CFU/mL以上，而檢測時間小于15min。秦璞等利用膠體金免疫層析技術研制了一種快速檢測遲鈍愛德華氏菌的試紙條，該試紙條對遲鈍愛德華氏菌有良好特異性，5~10min就可以得到檢測結果，敏感度達到105CFU/mL。近年來，出現了基于新型材料和免疫層析技術，如目前報道較多的有量子點（quantumdots，QDs）、上轉磷光（up-convertingphosphor，UCP）、納米磁珠、熒光微球等標記抗體的免疫層析。其中量子點與抗體偶聯后用于免疫層析顯示出良好的穩定性和熒光強度，在人類病原菌檢測上已經有所應用。Tully等初步建立了一種以量子點標記抗體檢測李斯特單增桿菌（Listeriamonocytogenes）表面蛋白InlB，檢測限可以達到12ng/mL。上轉磷光材料則因其背景干擾小、靈敏度高等特點，被應用于耶爾森氏菌和布魯氏菌的檢測中，其靈敏度是膠體金免疫層析技術的10倍。目前，以上新型材料還未見用于魚類病原菌檢測的報道，但這些材料在未來檢測試紙條研制中顯示出良好的應用前景。

1.4芯片技術

隨著近年來生物芯片技術的發展，以及病害檢測對大規模、高通量的要求，芯片技術越來越多被用到病原菌的檢測中。其中，應用最多的是基因芯片和蛋白芯片技術?；蛐酒夹g可以高通量、平行化對多種靶基因進行準確鑒定，為菌種鑒定提供了技術平臺。Panicker等也通過多重PCR與DNA芯片相結合建立了一種主要針對創傷弧菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌檢測沿海水域和甲殼類動物中的致病弧菌的方法，檢測靈敏度為102~103CFU/mL。蛋白芯片又稱蛋白微陣列，蛋白芯片是將各蛋白有序排列固定在載體上，之后用特異性標記的抗體或抗原蛋白與微陣列作用，經過掃描后確定蛋白間是否有相互作用。與基因芯片相比，蛋白芯片的研究仍處于摸索階段。究其原因是由于蛋白質分子本身結構功能的復雜性與特殊性造成的。目前蛋白芯片用于水產養殖細菌性病害檢測的報道較少。

2現有海水養殖細菌性病害檢測方法的利弊及發展方向

綜上所述，目前已報道多種海水養殖細菌性病害的檢測方法，這些方法各有優缺點，相比較而言，基于細菌富集培養及生理生化指標檢測的方法耗時、費力、精度和可靠性有限；基于分子生物學技術的檢測方法雖然靈敏度高、特異性強、快速準確，能夠檢測出樣品中的微量核酸，但是需要特定儀器設備并由專業技術人員操作，無法應用于基層養殖單位；基于免疫學技術ELISA檢測方法操作流程耗時繁瑣，無法實現對樣品的實時檢測。目前廣泛采用的膠體金免疫層析技術雖然操作簡便、耗時短、不需要專業技術人員操作，可以用于基層養殖場現場檢測，但靈敏度不夠高，導致一些發病癥狀不明顯或特異的病害無法在感染初期檢出并采取有效措施；基因芯片可高通量并行檢測，人為操作的誤差小，然而也存在價格昂貴等缺點。蛋白芯片技術雖然有著高特異性、高通量的特點，然而蛋白質結構復雜，合成困難，且蛋白較DNA更脆弱，易變性失活從而影響其性質和功能。

如何選擇有效的水產病害檢測方法，應根據施用單位的情況而異。對于具有一定實驗室條件的水產品檢驗檢疫單位或大型養殖企業，可以采用分子生物學技術，輔助以生理生化檢測手段，實現常規樣品的檢測。對于大量樣品，則可采用芯片技術進行高通量檢測，用于病害預警或附加值較高的水產品食品安全檢測。由于芯片制備復雜且檢測設備成本較高，影響了該技術的推廣。開發低成本芯片制備技術同時降低檢測設備成本是今后的發展方向。針對基層養殖單位或個體養殖戶，免疫層析試紙條因其操作簡單快速，攜帶方便而顯示出極大的優勢，但該技術靈敏度有限，無法實現病害感染早期診斷，限制了其在海水養殖細菌性病害檢測方面的進一步應用。制備具有更好親和力的單克隆抗體，采用新型抗體標記材料配合相應的便攜式熒光讀取器，不僅有助于免疫層析試紙條靈敏度的提高，還可以用于病害的半定量分析及多元化檢驗。目前已有研究人員研制出靈敏度是膠體金免疫層析試紙條10~100倍的免疫層析試紙條，雖然還處于實驗室階段，且生產成本還有待進一步降低，但相信未來此類產品將成為廣大養殖基層單位病害檢測的主流產品。

作者：肖婧凡王玥張元興雷霽霖單位：華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室中國水產科學院黃海水產研究所