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伴隨著工業、城市污染的加劇和農用化學物質種類、數量的增加，土壤重金屬污染程度也正在加劇，污染面積在逐年擴大。據有關統計報道，目前，我國重金屬污染土壤2000萬hm2左右，每年因土壤重金屬污染而造成的經濟損失達100多億元［1］。另一方面，土壤重金屬污染具有隱蔽性、積累性、滯后性和長期性的特點，存在修復難度大、去除效果不理想等問題［2］。因此，重金屬污染土壤修復成為環境科學研究中的熱點，我國也把重金屬污染列入優先控制之列［3］。在眾多去污染土壤修復技術中，土壤淋洗技術被認為是一種可廣泛應用的、很有發展潛力的修復方法［4］，其中研究應用較廣泛的是生物表面活性劑淋洗修復技術。例如，朱清清等［2］研究了皂角苷在不同濃度、pH值條件下對土壤重金屬去除影響，結果表明，當皂角苷濃度為50g/L、pH值為5.2時，土壤中Cd、Cu、Zn和Pb的去除率分別達45.6%、24.4%、19.0%和17.6%，說明生物表面活性劑對土壤重金屬的去除有一定的效果，但土壤污染呈現出多樣性和復合性，生物表面活性劑修復效果不理想。

生物酶是一種生物螯合劑，它具有對環境營養條件要求不高;低濃度污染物，處理更有效;在和毒物共存時能保持較高活性;在土壤中具有較大的移動性;微生物吸收有機物和重金屬時需借助特定吸收機制(擴散和滲透)，而酶不需要等優點，比微生物、植物對重金屬污染土壤的處理更具有優勢。當酶遇到重金屬時，重金屬與底物競爭，重金屬同時進入，與底物結合形成“酶-重金屬-底物”的絡合物，能降解和轉化土壤中的污染物，使污染物的濃度降低到可接受的濃度，土壤修復效果較好［7］。利用生物酶可有效提高重金屬污染土壤的處理效果，此方面研究國內外尚未見相關報道。本研究將生物酶溶液應用于污染土壤中重金屬Cd、Cr、Cu、Ni、Zn的淋洗、解吸、去除，以提高重金屬的去除效果。論文探討了酶的種類、酶的質量濃度、pH、反應時間等對重金屬去除率的影響，并利用響應面法對去除反應條件進行優化，試圖為淋洗修復重金屬污染土壤提供新方法。

1材料與方法

1.1供試土壤土壤樣品采自武夷山市武夷學院湖邊的耕地土壤，屬于粘土性土壤。樣品經自然風干后，研碎，過100目尼龍篩。人工污染土壤樣品:將100g土壤樣品浸入500mLCuSO4•5H2O、ZnSO4•7H2O、Cd(NO3)2•4H2O、Cr(NO3)3•9H2O、NiCl2•6H2O配制的混合溶液中(該溶液含Cu100.5mg/L、Zn439.7mg/L、Cd4.8mg/L、Cr365.2mg/L、Ni128.1mg/L)，25℃恒溫振蕩72h，4000r/min離心除去上層清液，自然風干陳化2周，備用，即為供試土壤樣品。經測試，該人工污染土壤樣品pH為6.80，有機質含量為2.87%，陽離子交換容量為12.45cmol/kg，Cd、Cr、Cu、Ni、Zn含量分別為2.38、93.33、279.38、148.39和89.68mg/kg。

1.2試劑與儀器試劑:α-淀粉酶，脲酶，過氧化物酶(生化試劑，上海鶴善實業有限公司);其他試劑均為市售分析純試劑，實驗用水為去離子水。儀器:AA-6300原子吸收分光光度計(日本島津公司)，SHA-C恒溫振蕩箱(常州國華電器有限公司)，TDL-40B離心機(上海安亭科技儀器廠)，PB-10型pH計(德國賽多利斯集團)，AB204-S電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1實驗用酶的選用取0.6g供試土壤樣品置于錐形瓶中，分別加入質量濃度為0.1%的不同酶溶液15mL，在25℃、pH4.0條件下恒溫振蕩12h，離心后，取上清液用火焰原子吸收分光光度法測定各重金屬的含量。

1.3.2酶溶液處理重金屬污染土壤各工藝條件的確定取0.6g供試土壤樣品置于錐形瓶中，加入一定量的酶溶液，在不同的反應時間、pH條件下，25℃恒溫振蕩。離心后，取上清液測定各重金屬的含量。

1.3.3酶溶液處理重金屬污染土壤工藝條件的優化取0.6g供試土壤樣品分別加入酶溶液15mL，根據Box-Behnken中心組合設計原理，在單因素的基礎上，以淋洗液的pH、反應時間、酶質量濃度3個因素為自變量，重金屬去除率為響應值，作3因素3水平的響應曲面分析實驗，實驗因素與水平見表1，確定土壤重金屬去除的最佳工藝條件。

2結果與分析

2.1實驗用酶的選用酶作為土壤的組成部分，參與土壤系統中許多重要的代謝過程，因而可用它來檢測土壤中重金屬的相對污染程度［8］。其反應機理是重金屬與酶活性中心結合或與酶分子中的巰基、胺基和羧基的結合，從而改變酶的活性。因此，酶依靠其專一性、高效性，與重金屬產生良好的絡合作用，從而達到去除土壤中重金屬的目的。實驗選擇土壤中常見脲酶、過氧化氫酶和α-淀粉酶溶液各15mL進行實驗，對供試復合污染土壤樣品進行處理，在25℃、pH4.0條件下恒溫振蕩12h，以求達到良好的去除效果和降低處理成本。由圖1可知，脲酶、過氧化氫酶、α-淀粉酶對土壤中重金屬的去除都有一定的效果，但效果差異顯著，去除率的大小順序為α-淀粉酶＞過氧化氫酶＞脲酶。其主要原因可能是，脲酶活性對重金屬最敏感，與重金屬的污染程度呈良好的負相關關系［8］，因此重金屬在濃度較低時，脲酶空間結構迅速變化而失活，無法進一步絡合重金屬;過氧化氫酶活性對重金屬Cu、Ni含量表現較敏感，故過氧化氫酶對部分重金屬如Cu、Ni，絡合效果差，對其他類型的重金屬有一定的絡合效果，去除重金屬效果要好于脲酶;重金屬與α-淀粉酶沒有專一性對應關系，酶活性沒有受到影響，對重金屬有良好的絡合效果。

2.2不同反應條件對重金屬去除效果的影響

2.2.1pH值對重金屬去除率的影響pH值對酶的生物活性會造成影響，還會對土壤中各重金屬的賦存形態造成影響，是影響土壤重金屬去除率的重要因素。在酸性條件下，土壤中的重金屬主要以酸提取態存在;pH越低，土壤中重金屬游離越多，活性越強。蔣煜峰等［9］發現，隨土壤pH值增加，重金屬解吸率逐漸減小，皂角苷沖洗土壤重金屬的適宜pH應在4～5。實驗選擇pH值3.0～5.0范圍內考察pH對重金屬去除率的影響。由圖2可知，在所研究的pH范圍內，pH值低，α-淀粉酶對重金屬的去除率較高，當pH為3.5時，去除率達到最大值。隨著pH值繼續增加，去除率降低。這種變化一方面與酶本身結構有關:在酸性條件下，α-淀粉酶分子中的巰基和羧基易分解，與重金屬產生良好的絡合。另一方面，與各金屬的賦存形態有關:在酸性條件下，Cd、Cr2種重金屬在土樣中的存在形態以酸提取態(即離子態)為主，去除率高;Cu、Zn、Ni在土樣中的存在形態以可還原態、可氧化態和殘渣態為主，去除較困難，去除率較低。

2.2.2酶的質量濃度對重金屬去除率的影響重金屬在土壤中的存在狀態大多數是吸附并固定在有機質和土壤粘粒上，以吸附態存在［10］。由圖3可知，酶質量濃度低于0.20%時，重金屬去除率隨酶濃度的升高而增加。Mulligan等［11］研究認為，在重金屬未與土壤分離時，酶就已經與重金屬絡合了，使金屬從土壤上解吸下來，隨著淋洗液不斷的沖洗，金屬就被從土壤中去除。在低濃度時，酶主要與土壤中游離的金屬絡合，重金屬的去除率低;隨著酶濃度的增大，土壤中重金屬進入酶的活性中心，與酶分子的巰基、胺基和羧基結合，重金屬不與土壤顆粒的重新結合，重金屬的去除率也隨之增加。當酶濃度超過0.20%時，與還原態、可氧化態和殘渣態的各重金屬的解吸與吸附達到動態平衡，重金屬去除率不再發生較大變化。不同重金屬去除率差別較大，可能是由于重金屬的存在形態以及重金屬與酶的絡合能力不同造成的。

2.2.3反應時間對重金屬去除率的影響由圖4可知，各重金屬去除率隨反應時間增加而上升，在反應時間為12h時，Cd、Cr、Cu、Ni和Zn去除率分別為69.56%、58.05%、35.72%、32.67%和53.39%。隨后，重金屬去除率不再變化。其可能與金屬離子在土壤中賦存狀態、酶的傳質速率機理和酶的反應機理有關。反應初期，酶分子吸附在土壤顆粒表面，重金屬的去除率低;隨著振蕩時間增加，酶的傳質速率提高，進入土壤中與重金屬相結合，去除率得到提高;當酶的活性中心達到飽和，與重金屬的絡合反應達到平衡，重金屬的去除率趨于穩定。

2.3酶溶液處理重金屬污染土壤最佳工藝條件的確定

2.3.1酶溶液處理重金屬污染土壤實驗分析和回歸方程建立(以Cd含量方差分析表為例)根據單因素實驗的結果，采用統計軟件Design-Expert進行實驗優化設計，實驗安排及實驗結果見表2。由表2實驗數據進行回歸分析，得二次多元回歸方程為。對該模型進行方差分析，結果見表3。從表3可知，模型具有高度顯著性(P＜0.01)，而R2=0.9651，R2Adj=0.9203較高，可見回歸方程擬合度和可信度均較高，實驗誤差較小，方程模擬得較好，可用于組合液去除污染土壤中Cd的實驗分析與預測。通過回歸模型的響應面和等高線圖(見圖5～圖7)，能夠很直接地看出反應因素之間兩兩交互作用對去除率的影響。從圖5～圖7可知，pH、反應時間、酶濃度的交互作用較顯著(圓形表示二因素交互作用不顯著，橢圓表示二因素交互作用顯著)［15］。其中各因素在實驗范圍內對去除率的影響大小依次為pH(A)＞反應時間(B)＞α-淀粉酶的質量濃度(C)。這3個實驗因素對去除率均產生不同程度的影響。在各因素選取的范圍內，通過DesignExpert軟件分析回歸模型，得出Cd最優去除率的工藝參數為:pH3.5、反應時間12h、α-淀粉酶的質量濃度0.20%，Cd去除率預測值為82.172%。為檢驗Box-Behnken實驗設計所得結果的可靠性，采用上述優化提取條件進行重復實驗，得Cd去除率為82.36%，與理論預測值相比，相對誤差為2.3‰，結果較理想。

2.3.2酶溶液處理重金屬污染土壤實驗優化結果分析本實驗利用響應曲面實驗分析方法還對Cr、Cu、Ni、Zn進行分析，結果表明，回歸方程擬合度和可信度均較高，實驗誤差較小，方程模擬的較好，可用于污染土壤中Cr、Cu、Ni、Zn實驗分析與預測。各因素在實驗范圍內對去除率的影響大小依次都為pH(A)＞反應時間(B)＞α-淀粉酶的質量濃度(C)。在各因素選取的范圍內，通過DesignExpert軟件分析回歸模型，得出最優去除率的工藝參數也為:pH3.5、反應時間12h、α-淀粉酶質量濃度0.20%。RSM預測出來的最佳結果Cr、Cu、Ni和Zn分別為75.02%、38.38%、34.69%和57.54%。為檢驗Box-Behnken實驗設計所得結果的可靠性，采用上述優化提取條件進行重復實驗，最終Cr、Cu、Ni和Zn去除率分別為75.44%、38.34%、34.74%和57.69%，與理論預測值相比，相對誤差分別為5.6‰、1.1‰、1.3‰和0.3‰，結果較理想。5種重金屬去除率的大小順序為Cd＞Cr＞Zn＞Cu＞Ni。

3討論

不同的酶對土壤中重金屬去除具有一定選擇性。與重金屬無專一性對應關系的酶，對重金屬有良好的去除效果。α-淀粉酶是較理想的重金屬絡合劑，對酸提取態、可還原態和可氧化態的重金屬有一定的去除效果，說明α-淀粉酶用于重金屬污染的土壤的生態修復是可行的。采用α-淀粉酶溶液作為淋洗液，通過響應面進行優化得到，以pH3.5、反應時間12h、α-淀粉酶的質量濃度0.20%為最佳淋洗修復條件，Cd、Cr、Cu、Ni和Zn去除率分別為82.36%、75.02%、38.38%、34.69%和57.54%，去除率的大小順序為Cd＞Cr＞Zn＞Cu＞Ni，此時Cd、Cr、Cu、Ni、Zn在供試土壤中含量分別由2.38、93.33、279.38、148.39和89.68mg/kg降低到0.41、23.31、172.15、96.91和38.08mg/kg。采用《土壤環境質量標準》(GB15618-1995)分析可知，Cd、Cr、Cu、Ni、Zn等重金屬的土壤環境質量標準值經生物酶處理后分別由3級或2級，提升到2級或1級，質量標準有一定的提高。表明酶對土壤中重金屬有較好的去除效果，酶是土壤的組成部分，利用酶修復重金屬污染的土壤，可以降低環境風險，具有一定的應用前景。

作者：林維晟 吳海泉 胡家朋 黃雪婷 徐穎惠 單位：武夷學院生態與資源工程學院 綠色化工技術福建省高校重點實驗室 福建邵化化工有限公司