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《北京農學院學報》2016年第3期

摘要:

【目的】克隆了脯氨酸脫氫酶ProDH基因的全長cDNA,構建了ProDH基因的RNA干擾植物表達載體,并轉化到農桿菌.【方法】以“耐運2000番茄”幼苗為試材,根據GenBna中公布的番茄脯氨酸脫氫酶ProDH基因的序列信息設計了一對特異性引物,克隆了該基因的全長cDNA,分析基因序列選擇正反向片段并擴增,并通過酶切、連接的方法構建了ProDH基因的RNA干擾植物表達載體PBI121GPDHi;利用凍融法將表達載體轉化到農桿菌EHA105中.【結果】所克隆到的ProDH基因片段長2001bp,其中CDS為1491bp,編碼380個氨基酸.測序結果與公布序列同源性100％,因此可以用來構建干擾載體;通過酶切與測序鑒定,證明表達載體構建成功.【結論】經特異性引物擴增檢測,證明表達載體已轉入農桿菌,為進一步的研究該基因奠定了基礎.

關鍵詞:

番茄;ProDH;RNA干擾;載體構建

番茄為茄科番茄屬的一年生草本植物[1G2].番茄原產于南美洲地區,已發展成為廣泛分布于世界不同地區的重要蔬菜作物[3G4].植物在逆境脅迫下的生理反應稱為逆境生理[5].對于抗寒性強的番茄品種,溫度低于10℃時生長發育受阻,5℃時表現寒害癥狀,生長完全停止[6].探索植物抗寒性的生理機制及其遺傳因素,在解決生產實際問題上具有廣泛的應用價值[7].植物抗寒基因工程研究包括導入調控功能基因和導入抗寒調控基因[8].植物體內脯氨酸含量在干旱、低溫、高鹽等滲透脅迫下會增加[9].逆境脅迫下植物體內的脯氨酸降解受到抑制[10].脯氨酸的積累能有效降低細胞質水勢,維持細胞內水分平衡,從而起到保護的作用[11].植物體內脯氨酸的含量在一定程度上可以反映植物對環境脅迫耐受能力的強弱[12].編碼運輸脯氨酸蛋白(ProT)的基因已經從擬南芥[13]、水稻[14]、番茄[15、大麥[16]等作物中克隆得到.編碼脯氨酸合成酶基因的研究較為深入,而在植物中對番茄脯氨酸脫氫酶基因的研究較少,主要在擬南芥、青花菜、甘藍等植物中,對青花菜的ProDH基因的RNA沉默,能夠有效的提高其對干旱脅迫和鹽脅迫的抗性[17].RNA干擾(RNAinGterference,RNAi)可以高效地抑制特定基因的表達,利用該技術可以有效地使目的基因沉默,所以作為分析特定基因未知功能的RNAi技術已廣泛應用于植物基因工程的研究中.本試驗旨在對番茄ProDH基因進行克隆與RNAi載體的構建,為開展ProDH基因的表達抑制、功能等研究打下基礎,通過基因沉默提高番茄的耐寒性.

1材料與方法

1．1材料

材料為番茄44號保存品種、中間載體HMWGInt和表達載體pBI121、根癌農桿菌菌株EHA105由北京農學院蔬菜遺傳育種與生物技術實驗室.pMD19GT克隆載體試劑盒為TaKaRa公司產品;大腸桿菌感受態DH5α購自北京天根公司.EASYspin植物RNA快速提取試劑盒、RNA清潔純化試劑盒、高純度質粒小量快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒均為北京Aidlab公司產品;LATaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶及各種限制性內切酶均為TaKaRa公司產品;利福平(Rifampicin,Rif)、卡那霉素(Kanamycin,Km)、氨芐青霉素(Ampicillinum,Amp)、XGGal、IPTG為Sigma公司產品.引物合成及測序由上海生工生物技術有限公司(北京部)完成.

1．2試驗方法

1．2．1番茄ProDH基因的克隆

按照EASYspin植物RNA快速提取試劑盒(Aidlab公司)說明書提取番茄葉片的總RNA,并用DNA酶Ⅰ消化處理,純化回收.測A260/280值,并用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質量,－80℃保存.用MGMLV反轉錄酶(TaKaRa公司)對總RNA進行反轉錄,獲得cDNA,－20℃保存備用.參照ProDH基因(GenGBan登錄號為BT012735)的序列設計特異性引物.上游引物為:5’GAAATTTCATCTTCCGCCGG3’,下游引物為:5’GTAGTCGGCGATGTTTCCTCG3’,由上海生工生物技術有限公司北京合成部合成.以cDNA為模板進行PCR擴增,以無菌水為模板做陰性對照.擴增產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測并回收.將目的片段與T載體(pMD19GT)連接.將連接產物加入DH5α感受態細胞中,菌液涂布并挑取平板上的白色單克隆,做菌落PCR陽性鑒定.將檢測正確的陽性克隆送去上海生工生物有技術限公司進行測序,由于片段較長,進行雙向測序,拼接.將測序結果與GenBna中注冊的番茄ProDH基因進行同源性比較.

1．2．2番茄ProDH基因RNAi表達載體的構建

利用DNAman軟件分析番茄ProDH基因的DNA序列,根據中間載體、表達載體和基因序列上的酶切位點,在開放閱讀框中選擇了240bp的CDS序列作為干擾目的片段,用PrimerPimer5r軟件設計含有酶切位點的引物.為使反向重復序列能夠插入表達載體PBI121的多克隆位點,分別在正反向引物中加入SacIBamHI、和SmaIB、glII酶切位點和相應的保護堿基.擴增反義片段引物為:5’GCGAGCTCAACTCTCCAATTCACGACAGG3’(含SacI酶切位點),5’GGGATCCTCAGCCCAAATGGAAAGCCCAG3’(含BamHI酶切位點);擴增正義片段引物為:5’GCCCCGGGAACTCTCCAATGTCACGACAGG3’(含SmaI酶切位點),5’GGAGATCTTCAGCCCAAATGAAAGCCCAG3’(含BglII酶切位點).以cDNA為模板,使用LATaqDNA聚合酶分別擴增正反義片段,以無菌水為模板做陰性對照.將PCR擴增產物電泳檢測后回收目的片段,分別和pMD19GT克隆載體連接,轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞.挑取單克隆,做菌落PCR鑒定.鑒定為陽性的菌液送去上海生工進行測序,將測序結果在NCBI上通過BLAST進行同源性比對.將鑒定為陽性的菌液用高純度質粒小量快速提取試劑盒提取正反義質粒,分別命名為Ps和Pa.所得到的質粒溶液用于后續試驗或置于－20℃保存備用.用SacI和BamHI分別雙酶切反義質粒Pa和載體質粒HMWGInt,用T4DNA連接酶將正義片段與中間片段連接,將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,用含有100mg/L氨芐青霉素的LB固體培養基培養過夜篩選重組子.挑取單克隆,用反義片段引物做菌落PCR擴增鑒定;用質粒回收試劑盒提取質粒DNA,用于酶切鑒定;將陽性單克隆的菌液送去公司做測序鑒定.將鑒定正確的質粒命名為HMWGIntGPa.用SmaI和BglII分別雙酶切質粒HMWGIntGPa和正義質粒Ps,用T4DNA連接酶連接正義片段和連有反義片段的中間載體并將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,用含有100mg/L氨芐青霉素的LB固體培養基培養過夜篩選重組子.挑取陽性單克隆用質粒回收試劑盒提取重組子質粒DNA,用于酶切鑒定.

1．2．3RNA干擾表達載體轉化根癌農桿菌

將－80℃保存的農桿菌菌液解凍活化,取3μL載體質粒加入到200μL冰上融化的農桿菌感受態細胞中,用槍輕輕混勻,冰浴30min;挑取農桿菌單菌落于1mLYEB液體培養基(含50mg/LRif,100mg/LKm)中,28℃振蕩培養過夜.用特異性引物PDHiaGF和GRGR進行PCR擴增驗證轉化子.

2結果與分析

2．1番茄葉片的總RNA

用核酸蛋白檢測儀檢測總RNA的濃度為756．9mg/L,OD260/280為2．03.圖1為番茄葉片總RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖.

2．2ProDH基因的克隆

以第一鏈cDNA為模板,用特異性引物進行PCR擴增,根據引物在ProDH基因上的位點,推斷擴增產物大小應該在1500bp左右.PCR擴增產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測,從圖2中可以看出,其擴增片段大約為1500bp,與預期大小一樣.純化回收目的片段后與pMD19GT克隆載體連接,轉化大腸桿菌感受態DH5α,藍白斑篩選陽性單克隆菌落搖菌,以菌液為模板進行PCR擴增,擴增產物經電泳檢測,擴增片段約為1．5kb,與預期大小相同,初步證明目的基因插入了pMD19GT載體.將檢測正確的陽性菌液送去測序,測序結果表明,PCR擴增產物長1579bp,含有擴增時所用的引物序列.對克隆得到的核苷酸序列進行同源性分析,通過Blast比對,與GenBna中ProDH基因序列(登錄號為BT012735)同源性為100％.因此,可以以此基因序列為基礎,構建番茄ProDH基因RNA干擾植物表達載體,進一步研究該基因的功能,為獲得抗寒性強的番茄植株奠定基礎.

2．3ProDH基因RNAi植物表達載體的構建

2．3．1中間載體的酶切鑒定

對構建好的中間載體質粒進行雙酶切鑒定,用內切酶SacI和BamHI進行雙酶切,預計切出約240bp的反向片段;用內切酶SmaI和BglII進行雙酶切,預計切出約240bp的正向片段;用內切酶SacI和SmaI進行雙酶切,預計切出包含正向片段、反向片段和內含子的約620bp的片段.酶切鑒定結果如圖3,分別切出了大約240bp、240bp和620bp的目的片段,說明中間載體已經構建成功,正向片段和反向片段分別插入到了內含子的兩側,中間載體構建成功.

2．3．2干擾載體鑒定

挑取陽性單克隆進行PCR擴增檢測,檢測用正義片段上游引物和內含子下游引物,預計擴增出大約380bp的目的片段,,菌液進行雙向測序,序列比對結果如圖4和5,干擾載體的主體部分和番茄ProDH基因序列同源性很高,并且正向片段兩端的酶切位點SacIBamH、I和反向片段兩端的酶切位點SmaIB、glII完好,說明番茄ProDH基因RNA干擾表達載體構建成功。

2．3．3干擾載體轉化農桿菌的菌液PCR鑒定

提取PBI121GPDHi表達載體質粒DNA,轉化農桿菌EHA105感受態細胞,篩選轉化子.挑取單菌落搖菌后,以菌液為模板進行CR擴增,檢測用特異性引物PDHiaGF和GRGR,擴增出大約380bp的目的片段(標出泳道序號),證明干擾表達載體已經成功轉入農桿菌中(如圖6).

3討論

以番茄cDNA為模版,對ProDH基因的克隆,用特異性引物進行PCR擴增,回收目的片段后與pMD19GT克隆載體連接,轉化大腸桿菌感受態DH5α,藍白斑篩選陽性單克隆菌落搖菌,成功擴增到番茄ProDH基因長約1．5kb的片段,編碼380個氨基酸,將檢測正確的陽性菌液送去測序,測序結果表明,PCR擴增產物長1579bp,含有擴增時所用的引物序列.對克隆得到的核苷酸序列進行同源性分析,與GenBna中ProDH基因序列(登錄號為BT012735)同源性為100％.連接T載體,轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α.挑取單克隆,做菌落PCR鑒定和測序檢測.對構建好的中間載體質粒進行雙酶切鑒定,分別切出了大約240bp、240bp和620bp的目的片段,說明中間載體已經構建成功,正向片段和反向片段分別插入到了內含子的兩側,中間載體構建成功.挑取陽性單克隆搖菌進行PCR擴增檢測,檢測用正義片段上游引物和內含子下游引物,預計擴增出大約380bp的目的片段,構建好的干擾載體TGDNA(如圖7)又插入到雙元表達載體PBI121的CaMV35S啟動子和NOSGter終止子之間.將檢測正確的干擾載體質粒命名為PBI121GPDHi.成功構建了番茄ProDH基因的RNAi植物表達載體PBI121GPDHi,表達載體是含有一段內含子的正反向重復序列.利用凍融法將表達載體轉化到農桿菌EHA105中,經特異性引物擴增檢測,證明表達載體已轉入農桿菌,為進一步的研究該基因創造了條件.與脯氨酸相關的抗寒基因工程的研究報道主要集中在脯氨酸運輸蛋白基因、脯氨酸合成反應限速酶基因和脯氨酸降解限速酶基因三個方面.利用基因工程手段進行脯氨酸代謝相關基因的植物遺傳轉化研究,以提高脯氨酸的積累,從而提高植物對寒冷脅迫的耐受力.編碼脯氨酸合成酶基因的研究較為深入,通過轉基因技術轉入脯氨酸合成酶相關基因,使植物產生更多的脯氨酸,鑒定其抗性的增強.

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作者:吳巧玲 任曉平 張喜春 單位:北京農學院植物科學技術學院