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《北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)》2016年第3期

摘要:

【目的】為優(yōu)化熒光定量pcr技術(shù)體系并在草莓研究中應(yīng)用.【方法】以二倍體草莓為試材,草莓當(dāng)中兩個βG肌動蛋白基因家族成員Actin1和Actin2為內(nèi)參基因,對比分析10μL和20μL反應(yīng)體系條件下熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng).【結(jié)果】內(nèi)參基因引物組合Actin1的擴(kuò)增效率等指標(biāo)優(yōu)于AcGtin2;10μL反應(yīng)體系中的擴(kuò)增效率等指標(biāo)優(yōu)于20μL反應(yīng)體系;內(nèi)參基因Actin1在10μL反應(yīng)體系下是草莓最優(yōu)的熒光定量PCR技術(shù)體系.【結(jié)論】優(yōu)化了草莓熒光定量PCR體系并應(yīng)用該技術(shù)體系檢測了草莓CrRLK1Ls家族成員的時(shí)空表達(dá)情況.

關(guān)鍵詞:

熒光定量PCR;內(nèi)參基因;草莓;擴(kuò)增效率;CrRLK1Ls 

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RealGtimePCR)技術(shù)是在普通PCR反應(yīng)中引入一種熒光化學(xué)物質(zhì),根據(jù)檢測到的即時(shí)熒光信號代表特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的量,并據(jù)此計(jì)算初始模板的量,實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的定量檢測[1].具有高靈敏度、高重復(fù)性、高安全性和高準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于臨床疾病[2G6],食品安全[7]和動物試驗(yàn)[8,9]等領(lǐng)域,植物領(lǐng)域已在玉米[10]、觀賞海棠[11]、葡萄[12]、紫蘇[13]等植物上廣泛應(yīng)用.實(shí)現(xiàn)了普通PCR從定性到定量的飛躍.熒光定量PCR技術(shù)通常需要采用一些表達(dá)穩(wěn)定的基因(內(nèi)參基因)作為內(nèi)部參照,去除不同處理在細(xì)胞數(shù)量、提取條件和上樣過程等方面存在的誤差.常用的內(nèi)參基因有甘油醛G3G磷酸脫氫酶基因、βG肌動蛋白基因、β2G微球蛋白基因、18SrRNA基因等[14].但是,這些內(nèi)參基因的表達(dá)量并不總是恒定不變的,在不同組織、發(fā)育階段和反應(yīng)條件下會有變化.因此,為了獲得準(zhǔn)確可信的基因表達(dá)量,在應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)時(shí)需要從引物特異性、內(nèi)參基因和反應(yīng)條件穩(wěn)定性等方面優(yōu)化改進(jìn).Feronia家族是古老而又保守的CrRLK1Ls基因家族的亞家族[15],草莓中有7個成員.目前,植物中關(guān)于該家族的研究多集中在擬南芥中,在園藝植物中的研究相對較少,未見相關(guān)報(bào)道.本研究利用優(yōu)化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析Feronia家族7個成員的時(shí)空表達(dá)特征,為今后研究該家族調(diào)控草莓生長發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

1．1植物材料和儀器

以北京農(nóng)學(xué)院組培中心栽培的二倍體草莓為試驗(yàn)材料,按照草莓果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期,分為綠果、白果、片紅和全紅四個時(shí)期,每個時(shí)期測定15個果實(shí)樣品,然后將樣品隨機(jī)分成3組,3個生物學(xué)重復(fù);草莓不同組織取樣,根取幼嫩的白根、莖取幼嫩的匍匐莖、葉取幼嫩的新葉、果取綠果期果實(shí),每個組織設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù),液氮速凍植物材料并G80℃冰箱保存?zhèn)溆?主要儀器型號為LightCycler96熒光定量PCR儀(德國羅氏公司).

1．2總RNA提取和cDNA的合成

草莓不同組織和發(fā)育期(根、莖、葉,綠果、白果、片紅果和紅果)總RNA的提取按照OMEGA植物RNA提取試劑盒法,具體步驟:在液氮充分研磨樣品,取100mg研磨好的樣品轉(zhuǎn)入1.5ml離心管,然后加入含1%βG巰基乙醇的裂解液500μL和PlanGtaid50μL,混勻,3~5min55℃水浴;然后離心10min,轉(zhuǎn)速為12000g,轉(zhuǎn)移上清液到一個新的離心管中;加入0.5體積的無水乙醇,立即上下翻轉(zhuǎn)混勻;轉(zhuǎn)移混合物至吸附柱中,室溫環(huán)境中放置2min,離心30s,轉(zhuǎn)速為12000g,棄掉廢液;加500μL去蛋白液,室溫環(huán)境中放置30s,離心30s,轉(zhuǎn)速為12000g,棄掉廢液;加700μL漂洗液,離心30s,轉(zhuǎn)速為12000g,棄掉廢液,重復(fù)本步驟;將吸附柱放回空收集管中,離心2min,轉(zhuǎn)速為12000g,盡可能除去漂洗液,防止漂洗液殘留乙醇抑制下游反應(yīng);將吸附柱放入一個RNasefree離心管中,加30~50μLRNasefreewater(事先在70G90℃水浴中預(yù)熱),室溫放置2min,12000g離心1min;收集到RNA放入－80℃保存?zhèn)溆?草莓不同組織總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA按照ReGverseTranscriptaseMGMLV(RNaseHG)試劑盒(TaKaGRa)進(jìn)行,具體步驟:5μL純化的總RNA與1μL的Oligo(dT)18Primer(50μmol/L)混合,70℃溫浴10min,冰上2min,加入5×MGMLVBuffer,dNTPMixGture,RNaseInhibitor,RTaseMGMLV,用ddH2O水定容并混勻,總體積為20μL.反應(yīng)條件為:先在42℃放置孵化1h,然后70℃溫浴15min,最后在4℃冷卻,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈,通過電泳檢測,將反轉(zhuǎn)錄合格的cDNA保存于－20℃冰箱.

1．3內(nèi)參基因引物設(shè)計(jì)和檢測

以二倍體草莓研究常用的兩個βG肌動蛋白基因(βGactin,ACTB)Actin1和Actin2作為內(nèi)參基因,在NCBI上的登錄號分別為XM_011471474.1和XM_004306544.2,用軟件Primer5.0分別設(shè)計(jì)3對引物,分別從中選出最優(yōu)的1對引物組合Actin1和AcGtin2,由上海生物工程公司合成.Actin1GF:GCGACAATGGAACTGGAATGG;Actin1GR:GACAATTTCCCGTTCAGCAGTG;Actin2GF:TGGGTTTGCTGGAGATGATG,AcGtin2GR:CAGTTAGGAGAACTGGGTGC.以綠果期cDNA為模板,普通PCR技術(shù)克隆兩個內(nèi)參基因片段,通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果檢測內(nèi)參基因引物.普通PCR技術(shù)反應(yīng)體系為:10×擴(kuò)增buffer4μL,dNTP0.8μL,cDNA模板1μL,TaqDNA聚合酶0.2μL,Mg2+1μL,ddH2O3μL,退火溫度54℃.陰性對照不加模板.

1．4實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

熒光定量PCR采用SYBRpremixEXTaqTMreagent試劑盒(TaKaRa),按說明書進(jìn)行.為確定最適的內(nèi)參基因和反應(yīng)體系,本試驗(yàn)設(shè)置4組實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng).第一組:內(nèi)參基因?yàn)锳ctin1,反應(yīng)體系為10μL;第二組:內(nèi)參基因?yàn)锳ctin1,反應(yīng)體系為20μL;第三組:內(nèi)參基因?yàn)锳ctin2,反應(yīng)體系為10μL;第四組:內(nèi)參基因?yàn)锳ctin2,反應(yīng)體系為20μL.本試驗(yàn)的模板為綠果時(shí)期的cDNA,分別進(jìn)行10倍梯度稀釋(1、10倍、100倍、1000倍、10000倍)開展熒光定量反應(yīng),然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.具體反應(yīng)體系見表1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性3min;94℃變性20s,退火溫度54℃,時(shí)間為20s,最后72℃延伸,時(shí)間為20s,共40次循環(huán).每次循環(huán)第3步進(jìn)行熒光信號采集,最后退火至65℃,每隔30s上升0.5℃,至95℃變性1min.檢測其熒光值,繪制溶解曲線.qRTGPCR反應(yīng)于德國羅氏LightCycler96熒光定量PCR儀上進(jìn)行.cDNA標(biāo)樣和待測樣均設(shè)置3次重復(fù).

1．5草莓FERONIA家族時(shí)空表達(dá)

采用優(yōu)化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,檢測Feronia基因家族成員在草莓根、莖、葉、果實(shí)等不同組織相對表達(dá)量,檢測在綠果、白果、片紅和紅果等不同時(shí)期相對表達(dá)量,反應(yīng)體系同上.數(shù)據(jù)采用SPSS13．0進(jìn)行方差分析,Excel2007作圖.

2結(jié)果與分析

2．1總RNA提取結(jié)果

高質(zhì)量的RNA是實(shí)時(shí)熒光定量PCR基礎(chǔ),利用OMEGA植物RNA提取試劑盒法提取總RNA,用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳對提取的總RNA進(jìn)行完整性檢測,在紫外成像系統(tǒng)上拍照分析,電泳結(jié)果如圖1所示,在28S和18S處呈現(xiàn)2條明亮的帶,無明顯脫尾現(xiàn)象,表明提取的總RNA完整性好,純度高.用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)進(jìn)行純度和濃度檢測,如表2所示,草莓不同組織和發(fā)育階段總RNA濃度均在300μg/mL,OD260/OD280值在2左右.說明本試驗(yàn)提取的總RNA質(zhì)量、純度和產(chǎn)量均滿足試驗(yàn)要求,幾乎不存在多糖等雜質(zhì)污染,反轉(zhuǎn)后的cDNA可以做熒光定量PCR.

2．2內(nèi)參基因引物

如圖2所示,在退火溫度為54℃的條件下,內(nèi)參基因引物組合Actin1和Actin2分別在240bp和230bp擴(kuò)增出單一明亮的條帶,陰性對照顯示無二聚體產(chǎn)生,說明兩個內(nèi)參基因均可應(yīng)用于后續(xù)試驗(yàn)。內(nèi)參基因Actin1目的條帶亮度高于Actin2的亮度,初步說明Actin1擴(kuò)增效率高于Actin2,可能更適用于熒光定量PCR.

2．3不同反應(yīng)體系熒光定量PCR結(jié)果

本試驗(yàn)設(shè)置了4組不同的熒光定量PCR反應(yīng)體系:Actin1G10μL體系、Actin1G20μL體系、AcGtin2G10μL體系和Actin2G20μL體系,4組不同的熒光定量PCR結(jié)果的擴(kuò)增效率、回歸系數(shù)和斜率數(shù)據(jù)見表3.可知4組反應(yīng)體系處理的的擴(kuò)增效率均在90％~102％之間,其中Actin1G10μL體系的擴(kuò)增效率最接近100％,Actin1G10μL、Actin1G20μL、Actin2G20μL3組處理的回歸系數(shù)均為0．998以上.說明Actin1G10μL是最優(yōu)的反應(yīng)體系,可以用于草莓基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。

2．4FERONIA家族在不同組織中的表達(dá)

試驗(yàn)檢測Feronia家族7個成員在草莓不同組織中的表達(dá)情況.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示(圖3),該家族7個成員在草莓根、莖、葉和果實(shí)中均能表達(dá),并且在根和葉片中的表達(dá)量相對較多,可能在葉片和根組織中承擔(dān)較多的功能.在擬南芥中的研究認(rèn)為,Feronia能夠促進(jìn)根毛和葉片的生長[16,17]. 

2．5FERONIA家族成員在不同發(fā)育時(shí)期的發(fā)表

本試驗(yàn)檢測Feronia家族在草莓果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況.RealGtimePCR結(jié)果顯示(圖4),Feronia亞家族在果實(shí)發(fā)育綠、白、片紅和全紅四個時(shí)期均有表達(dá),表達(dá)量隨著果實(shí)發(fā)育而降低,尤其是果實(shí)發(fā)育前期降低明顯.這說明,該基因?qū)麑?shí)發(fā)育可能有負(fù)調(diào)控作用,在擬南芥中的研究認(rèn)為,FerGonia能夠抑制授粉期間花粉管的生長[18].

3討論

不同植物、組織和不同發(fā)育期適合做內(nèi)參基因的候選基因是不同的,要獲得高質(zhì)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)的關(guān)鍵步驟就是確定穩(wěn)定高效的內(nèi)參基因.本試驗(yàn)對比研究了草莓中常用的兩個βG肌動蛋白(βGactin,ACTB)家族成員作為內(nèi)參基因,經(jīng)過篩選,均無引物二聚體,特異性強(qiáng),Actin1作為內(nèi)參基因特異性好和擴(kuò)增效率高,是適合的草莓內(nèi)參基因.熒光定量PCR費(fèi)用昂貴,為降低試驗(yàn)成本,試驗(yàn)將常規(guī)的20μL反應(yīng)體系減少至10μL,擴(kuò)增效率保持在90％~102％之間,標(biāo)曲的斜率都保持在G3~G3．5之間,尤其是Actin1G10μL反應(yīng)體系的擴(kuò)增效率為101．5％,比較研究發(fā)現(xiàn),10μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率均高于20μL反應(yīng)體系.同時(shí),熒光定量PCR反應(yīng)體系的引物濃度影響試驗(yàn)結(jié)果,如果引物濃度太低,使PCR反應(yīng)不完全,若引物濃度太高,則增加發(fā)生錯配以及產(chǎn)生非特異的產(chǎn)物的幾率.這說明Actin1G10μL反應(yīng)體系是草莓熒光定量PCR優(yōu)化的理想體系.草莓Feronia家族功能的研究主要集中在擬南芥中,在果樹上的研究未見相關(guān)報(bào)道.其在擬南芥中的功能研究主要集中在兩個方面,一個方面是該蛋白家族膜外Malectin結(jié)構(gòu)域作為受體與配基的互作研究;一方面是膜內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域參與介導(dǎo)下游的信號轉(zhuǎn)到作用,調(diào)控植物細(xì)胞的生長發(fā)育[16G19].2014年,Haruta等在SCIENCE雜志撰文,報(bào)道了FERONIA的膜外Malectin結(jié)構(gòu)域作為受體與快速堿化因子RALF直接互作,使膜外的PH值升高,抑制細(xì)胞的生長.該文章通過FERONIA的突變體fer開展研究,主要表型是根毛生長受到抑制.2014年,Duan等在NatureCommunication也報(bào)道了團(tuán)隊(duì)的最新研究進(jìn)展,詳細(xì)研究了FERONIA通過尿苷酸交換因子GEF與ROSp相互作用,調(diào)控質(zhì)膜活性氧的濃度變化,參與介導(dǎo)植物細(xì)胞的生長發(fā)育.研究發(fā)現(xiàn),突變體fer花粉管表現(xiàn)出生長過度和不破裂,影響精細(xì)胞的釋放,造成花粉受精失敗.該課題組還開展了很多相關(guān)的研究,比如FERONIA與內(nèi)源激素ABA的響應(yīng),與生長素IAA、與赤霉素GA,與油菜素內(nèi)脂BR等的響應(yīng).總的來講,該家族對植物的生長發(fā)育有兩方面的影響,一方面是促進(jìn)生長,表現(xiàn)在使子葉、子葉下胚軸、種子和氣孔細(xì)胞生長變大;另一面是抑制生長,表現(xiàn)在抑制根毛的生長和花粉管的伸長等.該家族與激素的關(guān)系,一般認(rèn)為,該家族的基因表達(dá)與生長素、細(xì)胞分裂素,赤霉素等正調(diào)控,與ABA等負(fù)調(diào)控.Feronia家族在草莓中的時(shí)空表達(dá)情況顯示,該家族應(yīng)該在草莓的生長發(fā)育過程中具有重要作用,尤其是對果實(shí)的發(fā)育.

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作者:張卿 邢宇 曹慶芹 秦嶺 單位:北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室