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摘要：采用水蒸氣蒸餾法對老鷹茶揮發油進行提取，以揮發油得率為指標，運用單因素實驗和正交實驗法考察了提取時間、料液比和超聲時間3個因素對老鷹茶出油率的影響，最佳提取工藝條件為：提取時間5h，料液比1:12，超聲時間60min。驗證實驗表明，優選工藝條件穩定可行，在該條件下提取率為(0.29±0.03)%。運用濾紙片法評價了老鷹茶揮發油的抑菌活性，結果表明老鷹茶對大腸桿菌抑制效果最佳(11.86mm±0.23mm)，其次是金黃色葡萄球菌、枯草桿菌及四聯球菌。

關鍵詞：老鷹茶；毛豹皮樟；揮發油；提取工藝；抑菌活性

毛豹皮樟(LitseacoreanaLevl.var.lanuginosa)為樟科(Lauraceae)木姜子屬(Litsea)常綠喬木，其葉片革質，呈倒卵狀橢圓形或倒卵狀披針形，嫩葉兩面被灰黃色長柔毛，主要分布于四川、重慶、貴州和安徽等地[1]，尤以四川及其周邊地區資源應用最廣。據《本草綱目》記載，毛豹皮樟可用于“止咳、祛痰、平喘、消暑解渴”，其嫩葉通常被當地居民制成具有消暑止瀉、消食解脹和保肝降脂等功能的茶飲，稱為老鷹茶[2-3]。老鷹茶是我國特有的傳統“別樣茶”，對其開發不僅可以提高產區農業經濟水平，也有利于產區旅游業發展。2009年老鷹茶榮獲雅安“產品優秀獎”，2010年入駐上海世博會，2011年作為四川省優秀國際旅游商品與外國旅游團成功合作，2012年作為中國地理標志產品進入第十三屆中國西部國際博覽會。研究表明，老鷹茶中揮發油含量豐富，主要為萜類活性物質[4]，如大牻牛兒烯B、欖香醇和沉香醇等[5]，具有抗氧化與抗菌[5]及抗突變和抗癌[6]等功效，故可作為抗氧化劑和抗菌劑之天然來源，也有成為新型抗腫瘤和抗癌藥物天然來源的潛力。現有研究多采用成本低、污染小的水蒸氣蒸餾法實現老鷹茶揮發油的提取，但尚未見對該法提取條件進行優化的報道。本研究以揮發油得率為考察指標，采用L9(34)正交實驗優選老鷹茶揮發油提取條件，并對其抗菌活性進行評價，為老鷹茶揮發油在天然抗菌劑和防腐劑等方面的開發利用提供科學依據和實驗數據參考，以期進一步提升老鷹茶的綜合經濟價值。

1材料與方法

1.1材料與試劑老鷹茶：四川省雅安市名山區中里鎮茶農提供，原料植物標本經中央民族大學生命與環境科學學院龍春林教授鑒定為毛豹皮樟(LitseacoreanaLevl.var.lanuginosa)的枝葉；實驗用水：蒸餾水；乙酸乙酯(分析純)、硫酸鈉、DMSO(二甲基亞砜)：北京化工廠；大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、枯草桿菌(ATCC6633)、四聯球菌(ATCC35098)：中央民族大學生命與環境科學學院；瓊脂培養基：北京酷來搏科技有限公司；濾紙：杭州特種紙業有限公司。

1.2儀器與設備高速粉碎機：永康市天祺盛世工貿有限公司；電子分析天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；98-1-B型電子調溫加熱套(1000mL)：天津市泰斯特儀器有限公司；KQ5200E型超聲儀：昆山市超聲儀器有限公司；RE-2000旋轉蒸發器：上海洪旋實驗儀器有限公司；揮發油提取裝置(冷凝管、10mL提取器、1000mL圓底燒瓶)：北京玻璃儀器廠；超凈工作臺：北京碧都空氣凈化設備公司；LRH-250-S恒溫恒濕培養箱：廣東泰宏君科學儀器股份有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1揮發油的提取

以《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄XD甲法為基礎，精密稱取粉碎40目的老鷹茶50g，置于1000mL裝有適量沸石的圓底燒瓶中，按單因素實驗和正交實驗設計加入適量蒸餾水，并進行超聲預處理。將燒瓶置于電熱套中，連接提取器和冷凝管，待加熱至沸騰后保持相應時間，關火靜置30min后讀取刻度，記錄揮發油體積，并計算樣品得率(mL/g)。將揮發油用乙酸乙酯萃取后旋蒸，并用硫酸鈉干燥，備用。得率=揮發油(mL)/老鷹茶(g)

1.3.2單因素實驗

經文獻調查和預實驗發現提取時間、料液比和超聲時間對老鷹茶揮發油得率有較大影響，設計單因素實驗(表1)考察3個因素對揮發油得率的影響，并以提取時間5h、料液比1:10和超聲時間40min作為控制變量的實驗條件。

1.3.3正交實驗設計

選用L9(34)正交表(表2)，以揮發油收率(mL/g)為評價指標，考察提取時間(A)、料液比(B)和超聲時間(C)對實驗結果的影響，并得出老鷹茶揮發油的提取工藝。1.3.4抑菌活性采用Verma等(2016)所報道的濾紙片法[7]并做相應調整，對老鷹茶揮發油的抑菌活性進行測試。挑取大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、枯草桿菌(ATCC6633)和四聯球菌(ATCC35098)菌落置于不同試管中，加入滅菌生理鹽水調整濁度，使其與標準0.5號麥氏比濁管的濁度相同，配制不同受試菌菌懸液。分別取上述4種菌懸液100µL用涂布器均勻涂于瓊脂平板上，靜置片刻后將含有揮發油溶液(DMSO，200mg/mL)或環丙沙星(陽性對照)的濾紙片(直徑6mm)置于涂菌平板上，37℃培養24h后，用游標卡尺測量并計算抑菌圈(mm)大小。抑菌圈(mm)=測量值(mm)—濾紙片直徑(mm)

2結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1提取時間對揮發油得率的影響

提取時間在一定范圍內對老鷹茶揮發油的提取率有明顯影響，且當提取時間為5h時得率最高(0.19%)，而超過這一提取時間后得率不再增加，證明老鷹茶揮發油在5h內可以提取完全。綜上可知，將提取時間3、5、7h這3個水平用于正交試驗。

2.1.2料液比對揮發油得率的影響

隨著蒸餾水的增加，老鷹茶揮發油的提取率也隨之提高，而當老鷹茶干粉末與蒸餾水比例為1:10時，其揮發油的提取率達到最高(0.17%)，而隨后即使增加用水量提取率也不再增加。因此，選取料液比1:8、1:10和1:12這3個水平進行下一步正交實驗。

2.1.3超聲時間對揮發油得率的影響

當超聲預處理時間在(0～40)min的范圍內時，老鷹茶揮發油的得率隨著超聲預處理時間的延長而增加，且當超聲時間為40min時得率最大(0.20%)，超過這一范圍后老鷹茶揮發油的得率不再增加，且隨之有下降趨勢。故選取超聲時間20、40、60min作為該因素在正交實驗(表3)的3個水平。

2.2正交實驗分析

從直觀分析結果可知，3個考察因素對實驗結果的影響順序為RA>RC>RB，即提取時間是對老鷹茶出油率影響最大的因素，其次是超聲時間和料液比。方差分析結果(表4)表明，提取時間和超聲時間可以顯著影響(P<0.05)老鷹茶揮發油的提取率，而料液比對實驗結果的影響不顯著。由于粉碎后的老鷹茶在提取過程中容易糊化，故料液比取1:12，最終結合直觀分析及方差分析結果確定最佳工藝水平為A2B3C3，即提取時間為5h、加水量為12倍、超聲時間為60min。

2.3驗證實驗

為排除實驗誤差，確定優選工藝的穩定性，取樣品3份，各50g，按確定的最佳工藝條件進行驗證性實驗，結果如表5所示，平均得率為2.4抑菌活性老鷹茶揮發油對4種受試菌的生長均有一定抑制作用，其中對革蘭氏陰性菌大腸桿菌最為敏感，抑菌圈直徑大小達(11.86±0.23)mm，其次是革蘭氏陽性菌，包括四聯球菌[(7.89±0.20)mm]、枯草桿菌[(7.59±0.43)mm]和金黃色葡萄球菌[(6.68±0.32)mm]。因此，老鷹茶揮發油具有一定的抑菌活性。

3結論

老鷹茶是我國特有的傳統藥食兩用植物，民間應用歷史已超百年。研究表明，揮發油是老鷹茶的主要活性成分之一，在食品和醫藥等方面都有很大應用潛能。本文以綠色、簡便、低成本的水蒸氣蒸餾法為基礎對老鷹茶揮發油的最佳提取工藝進行了研究，并采用濾紙片法對其抑菌活性進行了評價。結果表明，提取時間和超聲時間能顯著影響老鷹茶揮發油提取率，最佳提取條件為超聲60min、料液比1:12、提取5h。3次重復驗證實驗結果均高于文獻報道值，說明該工藝效率高且穩定可靠，可為老鷹茶揮發油的綠色工業化開發利用提供一定參考。抑菌測試結果表明，老鷹茶揮發油對測試中的革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)和革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、四聯球菌和枯草桿菌)均有一定敏感性，其中對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑制效果最佳。說明老鷹茶揮發油具有開發成為無毒無害的天然抗菌劑、保鮮劑和防腐劑的潛能，有望在食品加工和醫藥等方面發揮更大的價值，為當地可持續性生態經濟的發展做出貢獻。

參考文獻：

[1]　中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京:科學出版社,1986,31:296

作者：秦昭1；馮堃1；王文蜀1,2；馮金朝1 單位：1.中央民族大學生命與環境科學學院化學實驗中心，2.北京市食品環境與健康工程技術研究中心