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摘要:目的揭示海水魚腌制過程細(xì)菌群落組成及優(yōu)勢菌變化規(guī)律。方法采用構(gòu)建16SrDNA基因克隆文庫的分析方法檢測分析不同鹽魚比的海水魚腌制過程中細(xì)菌群落多樣性、優(yōu)勢菌群及其變化規(guī)律。結(jié)果1∶4和1∶8鹽魚比腌制海水魚前期(5d)優(yōu)勢菌群都為嗜冷桿菌屬，優(yōu)勢菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌;1∶4鹽魚比腌制海水魚中期(10d)優(yōu)勢菌群為嗜冷桿菌屬和假單胞菌屬，優(yōu)勢菌種為熒光假單胞菌和養(yǎng)料嗜冷桿菌，1∶8鹽魚比腌制海水魚中期(10d)優(yōu)勢菌群為嗜冷桿菌屬，優(yōu)勢菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌;2個鹽魚比腌制海水魚中后期(15d)優(yōu)勢菌群都為嗜冷桿菌屬，優(yōu)勢菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌;1∶4鹽魚比腌制海水魚后期(20d)優(yōu)勢菌群為嗜冷桿菌屬，優(yōu)勢菌種為Psychrobactersp．P2－18(2011)，1∶8鹽魚比腌制海水魚后期(20d)優(yōu)勢菌群為嗜冷桿菌屬，優(yōu)勢菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌。結(jié)論通過16SrDNA克隆文庫分析方法可檢測分析海水魚腌制過程細(xì)菌群落多樣性及變化趨勢，對腌制海水魚的質(zhì)量保持及食用安全具有重要意義。

關(guān)鍵詞:海水魚腌制;16SrDNA基因克隆文庫;細(xì)菌群落多樣性

腌制海產(chǎn)品是一種傳統(tǒng)的加工保藏產(chǎn)品，其不僅保存了海產(chǎn)品豐富的營養(yǎng)價(jià)值，且具有獨(dú)特的口感和風(fēng)味，深受大眾的喜愛，具有非常廣泛的市場需求［1］。腌制過程是以食鹽為主要輔料，在海產(chǎn)品表面直接撒上適量的固體食鹽(干腌法)或者將海產(chǎn)品浸入食鹽水中(濕腌法)［2］。海產(chǎn)品通過腌制能抑制腐敗菌生長，從而提高食品的防腐性能，延長保質(zhì)期，改善產(chǎn)品風(fēng)味。浙江東南沿海地區(qū)食用腌制海產(chǎn)品非常普遍，例如咸帶魚、咸黃魚、咸鰳魚等產(chǎn)品［3－5］。海產(chǎn)品腌制過程中作用的細(xì)菌菌群種類復(fù)雜多樣，有害菌群的大量繁殖會危害人體健康。普通的培養(yǎng)法不能完全反應(yīng)菌群種類的多樣性，很多菌群無法用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法生長［6］，分子生物學(xué)技術(shù)突破了傳統(tǒng)方法無法得到微生物純培養(yǎng)的限制，故廣泛應(yīng)用于不同樣品生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性的調(diào)查［7，8］。16SrDNA序列既有保守性，又具有高變性，保守性可以反映生物物種的親緣關(guān)系，并給分析系統(tǒng)發(fā)育提供了線索，而高變性能則可以表明生物物種的特征核酸序列，并且具有種、屬的結(jié)構(gòu)特征，因此，高變性是生物種屬鑒定的分子基礎(chǔ)［9］。16SrDNA序列分析目前已成為分子鑒定和系統(tǒng)學(xué)研究中最具權(quán)威性和準(zhǔn)確性的檢測方法之一［10］。16SrDNA基因克隆文庫分析方法能較好應(yīng)用于微生物的分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系［11］，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在土壤微生物系統(tǒng)、海洋微生物系統(tǒng)等環(huán)境微生物群落分析上均有應(yīng)用［12－14］。本文利用分子生物學(xué)技術(shù)，采用16SrDNA基因克隆文庫分析方法［15］，研究海產(chǎn)品腌制過程中細(xì)菌群落的多樣性及其變化，可為腌制海產(chǎn)品的食用安全性、品質(zhì)控制等提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1．1材料

海水魚購自中國浙江舟山市農(nóng)貿(mào)市場。

1．2儀器與試劑

MyCyclerPCR儀(美國Bio－Rod公司);GelDocXR凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio－Rod公司);Mini－SubCellGT電泳儀(美國Bio－Rod公司);MicrofellR離心機(jī)(德國BECKMANCOULTER公司)。Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(批號:SK8255);DreamTaq－TMDNA聚合酶(批號:EP0-702);Dntp(批號:D0056);SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(批號:SK8131);SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(批號:SK8191);pMD18－TVector連接試劑盒(批號:D101A);引物由中國上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1．3方法

1．3．1海水魚的腌制采用傳統(tǒng)干腌法腌制海水魚。將市場購買的海水魚(帶魚和黃魚)洗凈并去除內(nèi)臟，稱重并放入壇中，以一層魚一層鹽的順序進(jìn)行放置，鹽魚比分別為1∶4和1∶8。

1．3．2樣品總DNA提取采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，按試劑盒給定步驟，取0d、5d、10d、15d、20d的腌制海水魚制成的1∶10樣品液5ml進(jìn)行總DNA的提取。1．3．3PCR擴(kuò)增

1．3．3．1擴(kuò)增通用引物16SrDNA擴(kuò)增通用引物具體為7F(5'－CAGAGTTTGATCCTGGCT－3')和1540R(5'－AGGAGGTGATCCAGCCGCA－3')。

1．3．3．2PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增所用反應(yīng)體系:10×Buffer(含Mg2+)2．5μl、dNTP(各2．5mmol/L)1μl、DreamTaq－TMDNA聚合酶0．2μl、上游引物及下游引物(10μmol/L)各0．5μl、模板DNA0．5μl，用無菌ddH2O補(bǔ)足25μl體系。

1．3．3．3PCR循環(huán)條件PCR反應(yīng)的循環(huán)條件:94℃預(yù)變性4min，30個循環(huán)(94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min)，72℃修復(fù)延伸10min。

1．3．4純化回收采用1%瓊脂糖電泳，150V、100mA20min電泳觀察。PCR產(chǎn)物電泳條帶切割所需DNA目的條帶，采用純化試劑盒對目的條帶進(jìn)行純化回收。

1．3．5克隆測序按TakarapMD18－TVector連接試劑盒操作將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18－T載體連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E．coliJM109。將連接轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在預(yù)先用20μl100mmol/LIPTG和100μl20mg/mlX－gal涂布的氨芐青霉素平板上于37℃培養(yǎng)過夜。按SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒操作提取質(zhì)粒，用引物M13+和M13－進(jìn)行擴(kuò)增測序。5個時(shí)期共檢測300個陽性克隆。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

測得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對，分析出克隆所屬物種的系統(tǒng)位置和與之最近似的種類。

2結(jié)果

2．1不同鹽魚比樣品總DNA提取和PCR擴(kuò)增將1∶4和1∶82個鹽魚比的樣品不同腌制時(shí)期(0d、5d、10d、15d、20d)樣品稀釋液提取的總DNA用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測如圖1所示。從檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在約1500bp處均出現(xiàn)了熒光條帶，適合16SrDNA克隆文庫的構(gòu)建。

2．216SrDNA克隆文庫構(gòu)建2．2．11∶4鹽魚比腌制過程細(xì)菌16SrDNA克隆文庫構(gòu)建1∶4鹽魚比的海水魚腌制的5個不同時(shí)期150個陽性克隆子的測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對，150個克隆子與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知細(xì)菌的16SrDNA序列相似性為95%～100%。1∶4鹽魚比腌制海水魚不同時(shí)期細(xì)菌群落測定結(jié)果見表1。1∶4鹽魚比腌制海水魚，腌制開始(0d)主要菌屬有芽胞梭菌屬、假單胞菌屬、沙雷菌屬、金黃桿菌屬、嗜冷桿菌屬，優(yōu)勢菌屬為芽胞梭菌屬和假單胞菌屬，其中芽胞梭菌屬占53%，假單胞菌屬占30%，優(yōu)勢菌屬中的優(yōu)勢菌種分別為腐化芽胞梭菌和莓實(shí)假單胞菌;腌制5d主要菌屬有嗜冷桿菌屬、芽胞梭菌屬，優(yōu)勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占77%，芽胞梭菌屬占23%，優(yōu)勢菌屬中的優(yōu)勢菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌;腌制10d主要菌屬有假單胞菌屬、嗜冷桿菌屬、芽胞梭菌屬，優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬和嗜冷桿菌屬，其中假單胞菌屬占47%，嗜冷桿菌屬占37%，芽胞梭菌屬占16%，優(yōu)勢菌屬中的優(yōu)勢菌種分別為熒光假單胞菌和養(yǎng)料嗜冷桿菌;腌制15d主要菌屬有嗜冷桿菌屬、芽胞梭菌屬、藻青菌屬，優(yōu)勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占67%，芽胞梭菌屬占30%，優(yōu)勢菌屬中的優(yōu)勢菌種依舊為養(yǎng)料嗜冷桿菌;腌制20d主要菌屬有嗜冷桿菌屬、芽胞梭菌屬、藻青菌屬，優(yōu)勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占77%，芽胞梭菌屬占20%，優(yōu)勢菌屬中的優(yōu)勢菌種則發(fā)生了變化，由養(yǎng)料嗜冷桿菌變?yōu)镻sychrobactersp．P2－18(2011)。

2．2．21∶8鹽魚比腌制過程細(xì)菌16SrDNA克隆文庫構(gòu)建1∶8鹽魚比的海水魚腌制的5個不同時(shí)期150個陽性克隆子的測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對，150個克隆子與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知細(xì)菌的16SrDNA序列相似性為92%～100%。1∶8鹽魚比腌制海水魚不同時(shí)期細(xì)菌群落測定結(jié)果見表2。1∶8鹽魚比腌制海水魚，腌制開始(0d)主要菌屬有芽胞梭菌屬、嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬、紫色桿菌屬，優(yōu)勢菌屬為芽胞梭菌屬，占83%，其他菌屬占17%，優(yōu)勢菌屬中的優(yōu)勢菌種為解朊梭菌;腌制5d主要菌屬有嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬，芽胞八疊球菌屬，優(yōu)勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占70%，假單胞菌屬和芽胞八疊球菌屬分別占17%和13%，優(yōu)勢菌屬中的優(yōu)勢菌種為養(yǎng)料嗜冷桿菌;腌制10d主要菌屬有嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬，優(yōu)勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占93%，假單胞菌屬占7%，優(yōu)勢菌屬中的優(yōu)勢菌種依舊為養(yǎng)料嗜冷桿菌;腌制15d主要菌屬有嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬，優(yōu)勢菌屬為嗜冷桿菌屬，占90%，其他菌屬占10%，養(yǎng)料嗜冷桿菌在嗜冷桿菌屬中仍然占絕對優(yōu)勢;腌制20d主要菌屬有嗜冷桿菌屬、葡萄球菌屬、藻青菌屬，優(yōu)勢菌屬仍為嗜冷桿菌屬，占77%，葡萄球菌屬占20%，優(yōu)勢菌屬中的優(yōu)勢菌種仍然為養(yǎng)料嗜冷桿菌。

3討論

由16SrDNA克隆文庫分析結(jié)果可知，1∶4鹽魚比腌制體系不同時(shí)期總共檢測出6個菌屬19個菌種，1∶8鹽魚比腌制體系不同時(shí)期總共檢測出7個菌屬29個菌種，鹽度高低對腌制體系菌群構(gòu)成有一定影響，低鹽度的腌制體系菌群構(gòu)成比高鹽度的腌制體系菌群構(gòu)成更復(fù)雜，細(xì)菌種類更多。腌制前期(5d)，2個鹽魚比的腌制體系菌群組成不同，但優(yōu)勢菌屬和優(yōu)勢菌種一致，優(yōu)勢菌屬均為嗜冷桿菌屬，優(yōu)勢菌種均為養(yǎng)料嗜冷桿菌。腌制中期(10d)，1∶8鹽魚比腌制體系的菌群組成比1∶4鹽魚比腌制體系的菌群組成少了芽胞梭菌屬，1∶4鹽魚比腌制體系的優(yōu)勢菌屬除了嗜冷桿菌屬外增加了假單胞菌屬，而1∶8鹽魚比腌制體系的優(yōu)勢菌屬只有嗜冷桿菌屬，兩者有相同優(yōu)勢菌屬嗜冷桿菌屬和相同的優(yōu)勢菌種養(yǎng)料嗜冷桿菌，且養(yǎng)料嗜冷桿菌的占比較前一時(shí)期有所增加。腌制中后期(15d)，2個鹽魚比的腌制體系菌群組成依然不同，但優(yōu)勢菌屬和優(yōu)勢菌種一致均為嗜冷桿菌屬和養(yǎng)料嗜冷桿菌，且優(yōu)勢菌種養(yǎng)料嗜冷桿菌的占比都繼續(xù)增加。腌制后期(20d)，2個鹽魚比的腌制體系菌群都由3個菌屬組成，其中2個菌屬相同，只有1個菌屬不同，而優(yōu)勢菌屬都相同為嗜冷桿菌屬，優(yōu)勢菌種有所不同，1∶4鹽魚比腌制體系的優(yōu)勢菌種為Psychrobactersp．P2－18(2011)，1∶8鹽魚比腌制體系的優(yōu)勢菌種依然為養(yǎng)料嗜冷桿菌，且養(yǎng)料嗜冷桿菌的占比較上一時(shí)期都有所下降。上述表明，不同鹽度對海水魚腌制過程中的菌群構(gòu)成有所影響，但不影響優(yōu)勢菌屬及菌群的動態(tài)變化趨勢，優(yōu)勢菌屬嗜冷桿菌屬在不同鹽度的腌制過程中均占優(yōu)勢地位，且優(yōu)勢菌種養(yǎng)料嗜冷桿菌的變化趨勢相同。上述研究表明，16SrDNA克隆文庫分析方法可以較好分析海水魚腌制過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，菌群變化規(guī)律，一定程度上打破傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測的局限性［16－17］。通過分析細(xì)菌群落多樣性及變化趨勢對腌制海水魚的質(zhì)量保持及食用安全具有重要意義。

作者：孫瑛；王萍亞；黃朱梁；彭志蘭；崔潔 單位：舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院