本站小編為你精心準備了轉CaM基因提高棉花抗寒性參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《棉花學報》2016年第三期

摘要：

為了獲得耐低溫棉花新材料，通過花粉管通道法獲得了轉cam基因棉花，經過分子檢測得到了3個轉基因株系。同時對得到的轉基因株系的T4代（C1、C2、C3）和棉花受體（CK）在低溫處理后的相關生理生化指標進行了初步測定。發現在低溫（4℃）處理24h后，C1、C2、C3葉片中的丙二醛（MDA）含量明顯低于對照，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）的活力、可溶性糖的含量明顯高于對照，而常溫下（23℃）測定值沒有明顯的差異。表明轉CaM基因棉花在低溫時能夠通過減輕葉片膜脂過氧化程度，提高抗氧化酶活力等反應來緩解低溫對棉花葉片的損傷。本研究篩選出了3個具有一定抗寒能力的轉基因株系，為下一步選育抗寒新品種奠定了基礎，也為其他棉花抗寒轉基因技術提供了理論依據。

關鍵詞：

棉花；CaM基因；低溫脅迫；生理特性；膜脂過氧化；抗氧化酶；抗寒性

低溫傷害是影響北方春播作物生產的重要因素之一。河北省東北部和新疆部分地區棉田經常會受到倒春寒不同程度的影響，不僅影響了棉花的生長發育而且會增加生產成本。因此，研究和創制耐低溫的棉花新材料對棉花的生產和發展具有重要意義。植物的耐低溫性受多基因控制，并與其生理狀態（植株含水量、發育時期、營養狀況等）發生交互作用，因而利用傳統的遺傳改良方法提高植物低溫耐性受到較大制約。隨著生物技術的發展，利用轉基因技術提高植物抗寒性成為新的技術手段。目前，已有許多關于轉耐低溫基因的研究，如劉榮梅等[1]利用農桿菌介導法將擬南芥轉錄因子CBF3基因轉入煙草，獲得有一定抗寒性的煙草植株；Artus等[2]研究了擬南芥中耐低溫基因COR15a的表達，吳純清等[3]將CBF3和COR15a雙價基因轉入煙草來改善煙草抗寒性。此外，還有研究將昆蟲的抗凍蛋白基因Mpafp149轉入煙草[4]，CBF4基因轉入擬南芥[5]，美洲擬鰈抗凍蛋白基因（afp）導入番茄[6]，CBF1基因轉入水稻[7]等。用于棉花抗寒性改良的耐低溫基因有betA[8]、Mpafp149[9]、PEBP[10]等。一般認為鈣調素（Calmodulin，CaM）是一種在生物中廣泛分布，以Ca2+受體形式參與細胞中多種酶及眾多鈣依賴性生理調節過程，能調節細胞生長、分化等極為重要的多功能蛋白。Ca2+在植物低溫脅迫響應中可能主要起2方面的作用：一是通過穩定細胞膜結構，穩定一些重要蛋白質構象，提高某些保護酶的活性以增強植物的抗寒能力，二是Ca2+在植物對各種外界刺激產生特定生理反應中充當胞內信使，誘導抗凍基因的表達從而提高植物的抗凍力[11]。本研究將石斑魚（Epinepheluscoioides）鈣調蛋白基因CaM改造并轉化棉花受體，通過篩選陽性植株，初步分析轉基因株系在低溫處理后主要生理指標的變化，為下一步選育抗寒棉花新品種奠定基礎。

1材料和方法

1.1試驗材料石斑魚鈣調蛋白基因CaM（GenBank：KC540636），ORF（Openreadingframe）長度為450bp，編碼149個氨基酸殘基，2個Ca2+活性結合域。棉花受體為常規陸地棉品系08N109。

1.2CaM表達載體構建利用[12-13]對石斑魚鈣調蛋白基因CaM編碼蛋白二級、三級結構和配體結合位點預測，在保留功能基團的基礎上對其cDNA.列堿基剪切編輯。改造后的cDNA序列委托上海生物工程公司人工合成，并插入pEGM-T克隆載體，用XbaⅠ和SacⅠ酶切，同時與雙酶切載體pBI121連接，獲得表達載體pBI121-CaM，圖1為載體構建流程圖。

1.3花粉管導入外源CaM采用堿裂解法提取CaM菌液中的質粒DNA。將純化后的質粒DNA溶于pH7.6的TE緩沖液中，測得A260/A280為1.95。于2012年7月在棉花自交授粉當天下午16:00左右用50μL微量注射器將10～12μL含目的基因CaM的質粒溶液注入子房中，含CaM的質粒溶液的質量濃度為20ng•μL－1，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，待種子成熟后收集各株棉花的種子，播種得到T0轉化株系。將獲得的新個體（T0）自交獲得T1植株，繼續自交可獲得轉基因植株的T2、T3、T4，用于后續研究。

1.4轉基因植株的PCR檢測及測序采取各代轉化植株頂端新生葉片，用改良的CTAB法提取轉化植株T0、T1、T2、T3和對照植株基因組DNA[14]，以含有CaM基因的質粒DNA為陽性對照。以基因組DNA為模板，采取CaM基因的正反引物進行PCR檢測。上游引物：5'-ATGGCTGATCAGCTTACAGA-3'；下游引物：5'-TCAAAAGACACGGAATGC-3'。PCR檢測配備25μL反應體系：Mix12.5μL，PrimerF1.0μL，PrimerR1.0μL，DNA模板1.0μL，ddH2O9.5μL。反應條件為：94℃預變性10min，進入40個循環（94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸50s），72℃延伸10min。擴增產物用質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海Invitro-gen公司測序，重復3次，測序結果用DNAMAN軟件拼接、比對。

1.5轉基因植株的RT-PCR檢測通過CTAB-皂土法提取轉基因受體材料及T0轉基因植株基因組RNA[15]，采用瓊脂糖電泳檢測其完整性及純度。將受體植株和初步挑選出的陽性植株的RNA反轉錄為cDNA，利用特異性引物進行PCR擴增。1.6轉基因植株的抗寒能力測定抗寒能力測定是在T4棉花四葉期對對照及陽性植株進行抗寒初步鑒定。將檢測結果為陽性的3個植株（C1、C2、C3）自交獲得的T4種子與受體植株自交后得到的種子種植在蛭石上培養成為幼苗，選擇長勢相近的苗進行試驗。轉基因幼苗四葉期時從23℃的培養室轉入10℃緩沖間煉苗14h，然后轉入4℃的空間內處理24h，采取各植株同一位置的葉片測定其丙二醛（Malon-dialdehyde，MDA）、可溶性糖含量和超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxide，POD）活力等指標，每個株系設置3次重復。指標的測定參照高俊鳳[16]的《植物生理學實驗指導》中的方法進行。于上述抗寒指標測定取樣后，將幼苗移入10℃緩沖間放置14h，之后轉入23℃的培養室培養，觀察低溫處理后幼苗的恢復情況。采用MicrosoftExcel2007繪圖及DPS7.05統計分析軟件進行數據處理，并對指標差異顯著性采用Duncan’s新復極差法進行多重比較。

2結果與分析

2.1CaM基因的改造與表達載體

2.1.1CaM基因的改造及預測的蛋白構象。本研究將450bp的石斑魚鈣調蛋白基因CaM改造為282bp，編碼93個氨基酸殘基，保留了2個Ca2+活性結合域。目的基因的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列見圖2。通過RecognitionEngineV2.0軟件預測鈣調蛋白三級結構見圖3，其具有EF-hand結構域，能夠與Ca2+結合來調節多種代謝過程。

2.1.2目的基因的表達。在表達目的基因的植物表達載體中，目的基因由花椰菜花葉病毒35S啟動子驅動，胭脂堿合酶（NOS）終止子終止。標記基因為新霉素磷酸轉移酶基因nptⅡ（圖4）。

2.2轉CaM基因棉花的分子鑒定

2.2.1PCR檢測。為獲得能夠正常表達CaM基因的轉基因棉花，對234株T0單株進行了鑒定。利用CaM基因特異的上下游引物CAMF/CAMR，對T0代單株基因組DNA進行擴增，其中DNA-PCR檢測篩選得到15株陽性植株，圖5為部分檢測結果。

2.2.2RT-PCR檢測。提取受體材料和PCR檢測初步挑選出的15株陽性植株的RNA，電泳檢測無小分子彌散，說明RNA提取過程中沒有發生降解；電泳條帶無拖尾，點樣孔處無亮帶，說明提取的RNA中無蛋白質雜質：RNA質量較好，可以作為下一步PCR擴增模板。把上述RNA反轉錄成cDNA，利用特異性引物進行PCR擴增，去除假陽性株，篩選得到3株在300bp左右處有條帶（圖6）的陽性植株。可見，該基因在棉花中能夠表達；但整體轉化率還比較低，僅為1.3%。

2.2.33個轉CaM基因陽性株后代的PCR檢測和T4代基因回收測序結果。對3個轉CaM基因株系各代自交獲得的T1、T2、T3植株分別進行PCR檢測，將檢測到目的基因的植株進行自交，并對T4部分植株在四葉期進行檢測，結果顯示CaM基因在本代中均存在（圖7）。用PCR擴增產物進行測序，測序結果與改造后的CaM基因序列一致，該序列與石斑魚鈣調蛋白基因CaM（GenBank：KC540636）比對，結果為石斑魚鈣調蛋白基因CaM中的一段序列（圖8）。

2.3低溫（4℃）處理對轉基因和受體棉花的生理生化指標的影響

2.3.1植株的耐低溫試驗。在棉花四葉期對受體及陽性植株進行耐低溫能力的初步鑒定，經過處理后，受體植株葉片逐漸萎蔫，而篩選出的含有CaM基因的植株能夠恢復正常，表觀結果差異顯著（圖9）。

2.3.2低溫處理對棉花葉片中的MDA含量的影響。由圖10-A可見：常溫23℃下轉基因棉花株系（C1、C2、C3）與對照葉片中MDA含量均在40μmol•g－1左右，無明顯差異。經過低溫處理后，轉基因棉花各株系葉片中MDA含量比常溫高25%左右，株系間差異不顯著（分別為54.58，52.62，49.59μmol•g－1），而對照棉花葉片中MDA含量顯著上升為77.04μmol•g－1，比常溫下高90%左右，且顯著高于轉基因株系。

2.3.3低溫處理對棉花葉片中SOD、POD活力的影響。由圖10-B和圖10-C可見：在室溫下，對照和各株系的SOD、POD活力沒有明顯差異；在低溫處理后，轉基因株系葉片SOD、POD的活力顯著高于對照的。

2.3.4低溫處理對棉花葉片中可溶性糖含量的影響。陸地棉的品種抗寒能力與其在低溫鍛煉中可溶性糖的積累有十分密切的關系：可溶性糖積累可增大細胞液的濃度，以抵抗低溫對細胞膜造成的損傷。由圖10-D可見：低溫處理后轉基因株系葉片中的可溶性糖的含量明顯高于受體植株；而在室溫下，轉基因株系與受體間的差異不顯著。

3討論與結論

一般認為，0℃以上低溫脅迫對冷敏感植物的損傷首先是改變了磷脂雙層膜的膜相，尤其是改變了質膜的空間構象和物理狀態。膜相的改變可顯著抑制細胞膜正常功能的發揮，而構象的改變則強烈影響膜的穩定性，使蛋白質從膜上解離，并發生膜融合[17]。而Ca2+-CaM信使系統是調節植物抗寒性形成的有關生理生化過程的重要信號系統，Ca2+濃度的變化可以影響磷脂酶D的活力，進而進行膜脂代謝的調節[18]。此外，低溫能夠引起植物代謝過程及大量產物的變化，全面了解調控這些過程的關鍵基因，將有助于提高植物抗寒性。代謝產物及相關酶的變化能夠反映出植物耐低溫的程度。在低溫脅迫下，MDA會積累造成細胞膜孔隙變大，細胞膜透性上升，電導率變大，電解質外滲，導致細胞膜系統的嚴重損傷。SOD、POD作為清除植物體內產生的氧自由基的保護酶，對于維護植物尤其是處在低溫脅迫中的植物體內活性氧的產生和消除的代謝平衡起到極其重要的作用。在水稻幼苗受到低溫脅迫時，過氧化酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶在內的抗氧化酶活力增強，植株體內過氧化氫和丙二醛積累減少[19]。杜萍[20]通過對轉BvM14-CaM基因的煙草進行低溫、高溫、高滲、高鹽4種逆境脅迫處理，發現外源基因的插入提高了轉化植株對4種逆境的耐受力。這表明，CaM基因的表達與植物的抗逆性有關。很多植物在受到逆境脅迫之后，都會產生活性氧從而提高植物體內各種抗氧化酶的活力。

本研究中，所檢測棉花植株在受到低溫脅迫后，體內產生的SOD、POD等抗氧化酶活力均提高，但轉入CaM基因的各株系酶活力上升幅度較大，表明CaM基因可能在一定程度上提高了棉花對低溫逆境的耐受性。逆境脅迫會引起植物體內可溶性糖含量的變化。張小蕓等[21]研究轉冰草果聚糖-1-果糖基轉移酶基因（Ac1-FFT）的黑麥草時發現，經干旱處理后，轉基因黑麥草體內的可溶性糖含量明顯高于未轉基因的對照植株，這表明可溶性糖含量的提高可能會增強植物的抗逆能力。范月仙等[22]認為棉花苗期低溫處理后可溶性糖的提高可以作為抗冷級別的生化指標之一。本研究中，對棉花植株進行脅迫處理后，轉入CaM基因的株系中可溶性糖含量明顯上升，且上升幅度都比對照明顯，表明CaM基因能夠在一定程度上提高棉花的抗低溫能力。目前棉花抗寒性研究手段大多采用人工氣候室模擬低溫條件，雖然可以較好地控制溫度來評價低溫下棉花的表現，但用這種方法來推斷棉花在大田環境中的抗寒性具有很大的局限性，在以后的研究中應更多地結合野外試驗來綜合評定。此外，轉CaM耐低溫基因棉花種質尚需深入研究，其生理生化變化及遺傳穩定性還需要長期的試驗觀測，并通過完整的轉基因安全評價程序，才能在生產中得到應用。與傳統棉花育種方式相比，通過基因工程技術改善棉花的性狀相對快捷，但對于轉基因棉花中，外源基因能否高效穩定表達以及能否在后代中穩定遺傳仍然是轉基因棉花面臨的難題。外源基因在親代向子代傳遞的過程中，不可避免會產生外源基因片段丟失的現象，這導致轉基因棉花的應用受到很大的限制。此外，棉花對逆境脅迫的響應是由多種基因協調控制的，單一基因的導入的改良效應可能較小[23]；因此，應通過多個基因聯合導入來改善棉花的抗逆性。

作者：趙存鵬 郭寶生 王凱輝 劉素恩 王兆曉 劉冬艷 耿軍義 單位：河北省農林科學院棉花研究所 / 農業部黃淮海半干旱區棉花生物學與遺傳育種重點實驗室 /國家棉花改良中心河北分中心