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《棉花學報》2016年第三期

摘要：

在人工控制（培養基、水培、沙培）條件下，植酸酶基因phya具有分解利用培養基質植酸磷、提高磷素利用效率的功能，但在田間的表現目前尚未明確。在前期完成的PhyA轉基因陸地棉新材料盆栽試驗基礎上，將其種植在田間條件下，研究PhyA基因對棉花產量性狀的影響。結果表明，部分轉基因棉花新材料的單株結鈴數、鈴重、衣分、籽棉產量、皮棉產量與野生型對照存在顯著差異，PhyA在田間條件下具有改良轉基因棉花部分產量性狀的能力。在此基礎上，遴選出2個轉PhyA棉花優良新品系G3、G2，可用作今后轉植酸酶基因棉花新品種培育的基礎材料。

關鍵詞：

植酸酶基因PhyA；田間條件；陸地棉；產量性狀；植酸磷

土壤磷有50%～80%以非有效態（如有機態）形式存在，其中一半以上是植酸磷，而植酸磷大多不溶于水，不能被植物直接吸收利用[1-2]。然而，植酸磷可經植酸酶水解后釋放出無機磷進而被吸收利用，因而植酸酶基因在分解利用植株根際周圍培養基質有機態磷方面具有重要應用[3-6]。有學者發現，如果在無機磷含量較低的培養基質中添加一些能夠分泌胞外植酸酶的土壤微生物，或者在這些培養基質中直接添加一些純化后的植酸酶，能夠明顯提高植物對根際土壤中植酸磷的利用能力[7-10]。據統計，自Richardson等[11]首次將黑曲霉PhyA轉入擬南芥證實植酸酶基因可用于提高培養基質有機態磷利用效率以來，研究者已陸續將黑曲霉、無花果曲霉、煙曲霉、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、苜蓿、大豆中的植酸酶基因轉入不同植物，并得到了類似結論[12-22]。目前關于植酸酶基因的多數研究還局限在少數模式植物，且多是在實驗室無菌環境下開展的，測定指標也多圍繞轉基因植株能否分解利用“人為添加或控制”的植酸磷。而關于大田農作物的類似研究，即轉基因植株在田間條件下的生長研究卻寥寥無幾。并且，到目前為止，關于利用植酸酶基因選育出有機磷高效利用植物新品種的成功報道還很少[23]。孔凡利等[24]將枯草芽孢桿菌的植酸酶基因PhyA轉入煙草中，在培養基條件下，轉基因煙草對植酸磷的吸收利用能力、植株生物量及總磷吸收量顯著高于野生型；而在沙培和土培條件下，轉基因煙草對植酸磷的吸收利用效率、植株生物量和總磷吸收量與野生型差異不顯著。George等[25-27]發現，在控制條件下（如培養基條件），轉植酸酶基因的小麥品種表現出較高的有機磷分解利用能力；而在田間條件下，與野生型相比，轉基因小麥并未表現出任何顯著差異，其分解利用有機磷的能力也未顯著提高。由此可見，控制條件和田間條件下的植酸酶基因在發揮功能方面并不完全一致。因此，在克隆、轉化植酸酶基因，獲得轉基因材料，并完成室內試驗的基礎上，進一步在田間條件下繼續深入研究植酸酶基因及其功能，遴選在田間條件下具有分解有機態磷能力的轉基因新品系，就成為當前開發利用植酸酶基因、選育有機磷高效利用轉基因農作物新品種的重要前提，對于今后解決全球范圍內的土壤“遺傳學缺磷”問題意義重大。在本課題組前期已將無花果曲霉的植酸酶基因PhyA轉入棉花，獲得轉基因棉花新材料，并已在人工控制條件下完成轉基因新材料分解利用培養基質（無菌培養基、Hoagland營養液、蛭石）植酸磷相關研究[28-31]的基礎上，本研究進一步分析這些轉基因新材料在田間條件下的性狀表現，并遴選表現優異的轉基因棉花新品系，探討在田間條件下利用植酸酶基因改良棉花相關性狀的可行性，為今后選育分解利用土壤有機磷轉基因棉花新品種奠定理論與材料基礎。

1材料和方法

1.1供試材料轉植酸酶基因PhyA棉花新材料T5。在課題組前期工作中，這些新材料已通過PCR(Poly-merasechainreaction)、Southern雜交、Northern雜交等技術證實目的基因整合在棉花基因組、且能夠在RNA水平轉錄表達，同時在水培和盆栽條件下經過植酸酶活性檢測、植株磷含量測定、根際周圍植酸磷利用分析等研究，證實該基因在室內控制條件下具有分解利用培養基質植酸磷的功能[29]。其中包括農桿菌介導轉化獲得的新材料5份（A1、A2、A3、A4、A5），受體品種為農大94-7（CK1），基因槍轉化獲得的新材料5份（G1、G2、G3、G4、G5），受體品種為農大KB18（CK2）。

1.2研究方法

1.2.1轉基因新材料在田間條件下的種植與管理。將轉PhyA棉花新材料T5種植在田間條件下（網室內），所選種植地點為連續3年未施用磷肥的土壤。試驗采用單因素隨機區組設計，3次重復，2行區，行長7m，行距80cm，株距33cm，密度3.75萬株•hm－2，管理方法與大田管理條件基本相同。

1.2.2轉植酸酶PhyA陽性植株鑒定與篩選。對生長到3至5葉期的轉基因棉花新材料T5，利用4000mg•L－1卡那霉素涂抹葉片，7d后觀察顏色變化，篩選抗性植株。將抗性植株進行標記，提取基因組DNA，進行植酸酶PhyA的PCR檢測。檢測引物為F3：5'-GGGCTTCCAGAGCACTAA-3'，R3：5'-ACCAAGACACGGACCAAA-3'，擴增片段長度為750bp；F4：5'-CCAGCACATCCAACAA-CACTCTCG-3'，R4：5'-ATCGTCCAGGCAGATG-AGAACCC-3'，擴增片段長度為600bp。

1.2.3田間產量相關性狀測定。以受體材料（野生型，農大94-7、農大KB18）為對照，調查田間條件下轉PhyA棉花新材料的株高、第一果枝節位、第一果枝節位高度、單株果枝數、單株結鈴數、爛鈴數、鈴重、衣分、籽棉產量、皮棉產量等性狀。性狀調查分3個重復，每重復調查10個單株，具體方法參照《國家棉花品種區域試驗調查標準》。數據統計分析采用DPS3.01軟件。

2結果與分析

2.1卡那霉素篩選與鑒定對T5的卡那霉素涂抹試驗發現，野生型對照植株葉片出現黃色褪綠現象；而轉基因植株由于帶有卡那霉素抗性基因，因而其葉片呈現正常綠色，未出現褪綠現象（圖1）。隨后，根據T5轉基因新材料卡那霉素抗性鑒定結果，篩選出抗性植株進行后續試驗。

2.2基因檢測與植株入選將入選的卡那霉素抗性植株進行標記，以未轉化的受體品種為對照，提取植株基因組DNA，進行植酸酶PhyA的PCR檢測。為保證PCR擴增的準確性與可靠性，分別采用2對植酸酶PhyA基因特異引物（F3、R3；F4、R4）進行PCR檢測，PCR檢測試驗獨立重復3次，結果（圖2）發現，均能夠按照預先設計引物擴增出目的條帶（F3、R3引物擴增片段長度為750bp，F4、R4引物擴增片段長度為600bp）。同時，為進一步驗證PCR擴增結果，回收上述目的條帶，經連接pGM-T載體，轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取單克隆進行菌液PCR，并選取陽性單克隆菌液進行目的條帶的DNA測序分析，結果發現，所回收的10個轉基因植株樣品的目的片段（其中5個樣品采用F3與R3引物擴增，另5個樣品采用F4與R4引物擴增）測序結果與轉入的無花果曲霉的植酸酶PhyA基因序列（GenBankNo.AF537344）完全相同，說明植酸酶基因PhyA確實已穩定地整合至棉花基因組；根據PCR檢測結果（圖3），篩選出A1―A5、G1―G5轉基因株系各30株進行產量相關性狀分析。

2.3轉基因新材料在田間條件下的產量性狀分析分析農大94-7轉基因棉花新材料在田間條件下的產量相關性狀結果（表1）發現：A4株系的鈴重顯著高于野生型對照，A2、A1、A3、A5株系的衣分均顯著高于野生型對照；而其他產量相關性狀，如株高、第一果枝節位高度、第一果枝節位、單株果枝數、單株結鈴數、爛鈴數、籽棉產量、皮棉產量均未顯著超過野生型對照。說明PhyA的轉入有利于改良轉基因棉花農大94-7株系的鈴重與衣分。通過分析農大KB18轉基因新材料在田間條件下的產量相關性狀（表1）發現：G3株系的單株結鈴數和衣分顯著高于野生型對照，G5株系的鈴重顯著高于對照，G3、G2株系的籽棉產量與皮棉產量均顯著高于野生型對照；而其他的產量相關性狀，如株高、第一果枝節位高度、第一果枝節位、果枝數、爛鈴數則與對照的差異未達到顯著水平。說明植酸酶PhyA的轉入有利于改良轉基因棉花農大KB18株系的單株結鈴數、鈴重、衣分、籽棉與皮棉產量。

2.4轉植酸酶基因PhyA棉花優良新品系遴選通過分析10個轉基因株系與野生型對照在田間條件下的產量相關性狀，遴選出轉PhyA棉花優異新品系2個，分別為G3與G2。其中G3株系的衣分、單株結鈴數、籽棉與皮棉產量均顯著高于野生型對照，分別增加8.26%，24.07%，32.08%，42.95%，在供試株系中表現最優；G2株系的籽棉產量與皮棉產量顯著高于野生型對照，分別增加23.95%，27.37%，表現較好。這2個轉基因株系可用作轉植酸酶基因PhyA棉花新品種培育的基礎材料。

3討論

磷肥易被固定形成有機態，貯存于土壤中，不能被當季植物吸收利用，造成土壤“遺傳學缺磷”[32]。如何充分利用土壤中的有機態磷（尤其是植酸磷），減少外部磷肥施入量已成為農作物土壤養分研究的重要課題。目前，有多位學者[11-31]利用酸性磷酸酶、植酸酶基因轉入不同植物，探討利用基因工程手段改良土壤磷素利用效率的可行性。這些研究分別在培養基、水培、蛭石或沙培條件（控制條件）下，通過外源添加植酸磷或有機磷（模擬田間條件），證實了轉化基因具有分解培養基質中有機態磷的功能。然而，關于田間條件下的植酸酶基因作用潛力研究報道甚少，且所得結論與控制條件不同[23,33]。分析其原因，可能是由于轉基因植株根際周圍的田間環境比室內控制條件要復雜得多，具有不可預測和難以控制的特點。在完成室內控制條件下轉PhyA基因材料分解利用培養基質（無菌培養基、Hoagland營養液、滅菌蛭石、盆栽）植酸磷相關研究的基礎上，本研究進一步分析這些材料在田間條件下的性狀表現，并遴選出表現優異的轉PhyA基因棉花新品系。通過分析轉植酸酶基因棉花新材料在田間條件下的產量性狀發現，部分轉基因株系的鈴重、衣分、單株結鈴數、籽棉產量與皮棉產量顯著高于野生型對照，而株高、第一果枝節位高、第一果枝節位、單株果枝數則與野生型對照差異不顯著，并且不同株系表現不同。在此基礎上，遴選出2個表現較好的轉基因新品系。另外，受體品種農大94-7在低磷條件下的衣分數值偏低（32.1%），而轉入植酸酶基因的農大94-7新材料如A1、A2、A3，其衣分值則可達到37%～38%，基本接近正常，說明轉基因新材料由于含植酸酶基因，能夠分解利用根際周圍的有機態磷，因而受低磷影響較小。進一步分析本研究結果與課題組前期研究報道[28-31]可以發現，PhyA的轉入，使得植株在蛭石盆栽與田間條件下的單株結鈴數均顯著提高，且提高了植株在蛭石盆栽條件下的衣指與20鈴皮棉質量以及在田間條件下的衣分、鈴重、皮棉產量與籽棉產量。由此可見，轉入植酸酶基因PhyA不僅增加了棉株結鈴數，而且提高了棉鈴中的纖維產量，因而對于培育土壤有機磷高效利用、皮棉產量有所提高的棉花新品系具有重要意義。

4結論

對轉植酸酶PhyA棉花材料在田間條件下的產量性狀分析發現，農大94-7轉基因株系的鈴重、衣分顯著高于野生型對照，農大KB18轉基因株系的單株結鈴數、鈴重、衣分、籽棉產量、皮棉產量顯著高于野生型對照。這說明PhyA在田間條件下具有改良轉基因棉花部分產量性狀的能力。依據10份轉基因新材料產量性狀表現，篩選出轉基因品系G3與G2，可作為培育磷營養高效利用轉基因棉花新品種的基礎材料。

作者：柯會鋒 王省芬 吳立強 李志坤 張艷 張桂寅 馬峙英 單位：河北農業大學 / 教育部華北作物種質資源研究與利用重點實驗室