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摘要：目的從西洋參總皂苷中制備出6種人參皂苷，并研究其體外抗氧化能力。方法利用皂苷分組、高溫堿降解、氧化環合等方法制備分離出六種人參皂苷，通過試劑盒分別以總抗氧化能力，羥自由基清除能力為檢測指標，設計濃度梯度，以抗壞血酸（VC）為陽性對照，對6種的人參皂苷的抗氧化能力進行評價。結果制備出的6種皂苷分別為（20S）-原人參二醇、（20S）-原人參三醇、（20S,24R）-奧克梯隆、（20S,24S）-奧克梯隆、（20S,25R）-26-羥基二醇和(20S,25S）-26-羥基二醇，其抗氧化能力有劑量效應，濃度越大，抗氧化能力與羥自由基清除能力越強。六種人參皂苷羥自由基清除能力>抗氧化能力。抗氧化能力的大小依次為（20S）-原人參二醇>（20S）-原人參三醇>（20S,25S）-26-羥基二醇>（20S，24R）-奧克梯隆>（20S，24S）-奧克梯隆>(20S,25R）-26-羥基二醇。結論六種人參皂苷體外均具有一定的抗氧化活性，為人參皂苷發揮藥理作用及相關機制研究提供參考和借鑒。

關鍵詞：人參皂苷；羥自由基清除能力；抗氧化能力

引言

人參屬于五加科多年生草本植物，具有補五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目開心益智之功效[1]。現代醫藥學研究發現，人參的功效成分主要是人參皂苷和人參多糖。人參皂苷根據皂苷元的不同，主要包括達瑪烷型四環三萜（包括原人參二醇型和原人參三醇型皂苷）、奧克梯隆型四環三萜和齊墩果酸型五環三萜[2-4]。隨著人參皂苷研究的不斷深入，目前人參皂苷的制備方法主要有酸水解法、堿水解法、酶解法、縮合法、氧化環合等。現代研究表明，人參皂苷中的部分單體皂苷如rb1、rb2、rd、rc、re、rg1、rg2、rh1等可不同程度地減少體內自由基含量，可延緩神經細胞衰老并降低老年發生的記憶損傷、以及發揮心腦血管和抗癌方面的藥理作用。本文利用堿降解和氧化環合兩種方法的結合制備出了六種人參皂苷，（20s）-原人參二醇、（20s）-原人參三醇、（20s,24r）-奧克梯隆、（20s，24s）-奧克梯隆、（20s,25r）-26-羥基二醇和(20s,25s）-26-羥基二醇，并以總抗氧化能力，羥自由基清除能力為檢測指標，設計濃度梯度，以抗壞血酸（Vc）為陽性對照，對六種的人參皂苷的抗氧化能力進行評價。

1材料與方法

1.1儀器與試劑電熱恒溫水浴鍋；電子天平（esJ200-4B）：沈陽龍騰電子有限公司；紫外可見分光光度計（UV2800）：日本島津；移液槍:大龍興創實驗儀器（北京）有限公司；95%乙醇；西洋參總皂苷；柱層析硅膠（200-300目）：青島海洋化工有限公司；硅膠G板：青島海洋化工有限公司；1,2丙二醇，氫氧化鈉，硫酸，無水乙醇，二氯甲烷，甲醇，乙酸乙酯，石油醚，鹽酸，二氧六環，過氧間氯苯甲酸均為分析純；總抗氧化能力試劑盒（貨號：YX-c-a504）：上海優選生物科技有限公司；羥自由基清除能力測定試劑盒（貨號：YX-c-a505）：上海優選生物科技有限公司；雙蒸水自制。

1.2樣品制備西洋參總皂苷200g以500ml95%乙醇加熱溶解，取氫氧化鈉20g加入32ml水溶解，待全部溶解后加入2000ml乙醇，混勻（醇鈉溶液），將醇鈉溶液緩緩加入到總皂苷乙醇溶液中，邊加邊攪拌，放置過夜。沉淀部分為二醇組粗品，轉移至搪瓷盤中水浴加熱蒸干，濾液部分為三醇組粗品，以鹽酸調pH值6.5-7.0，回收乙醇，蒸干，得三醇組粗品。將二醇組粗品和三醇組粗品分別加入到反應釜中，以1,2丙二醇為溶劑，加入375gnaoH，并使釜內溫度保持170℃36h。反應結束后用適量自來水稀釋，沉淀析出，放置過夜。抽濾，濾液棄掉，沉淀用水反復沖洗，至pH~7.0，轉移至搪瓷盤，85℃干燥，即得的原人參二醇和原人參三醇粗品，分別經柱層析分離，以二氯甲烷：甲醇（25:1）為洗脫劑洗脫，得（20s）-原人參二醇(PPd)、（20s）-原人參三醇（PPt）。將PPd和PPt中分別加入1,4-二氧六環中，經濃硫酸調節pH值為3-5，在攪拌下逐滴加入氧化劑過氧間氯苯甲酸，于75℃~85℃加熱回流40分鐘，冷卻至室溫，用0.1M氫氧化鈉水溶液調節pH值7.0，過濾并濃縮濾液。再以石油醚：乙酸乙酯（1.5:1）為洗脫劑經柱層析分離、重結晶得純品。經與文獻中氫譜和碳譜比對[4-5]，該四種人參皂苷分別為(20s,25r）-26-羥基二醇簡稱（25r）-HPd、(20s,25s)-26-羥基二醇簡稱(25s)-HPd、(20s,24r)-奧克梯隆簡稱(24r)-ocotillol、(20s,24s)-奧克梯隆簡稱(24s)-ocotillol。6種人參皂苷的制備見圖1。

1.3抗氧化試驗1.3.1總抗氧化能力檢測將PPd、PPt、(24r)-ocotillol、(24s)-ocotillol、(25r)-HPd和(25s)-HPd分別配制成3.0mg/ml母液，配制Vc陽性對照母液3.0mg/ml。再將上述母液分別稀釋為1.5mg/ml，0.75mg/ml，0.375mg/ml的樣品，運用上海優選生物科技有限公司試劑盒（貨號：YX-c-a504）測定，詳細步驟按試劑盒說明書進行操作，配置成反應總體積為1.02ml，反應中樣品體積為0.03ml的反應液，經過顯色和紫外下比色，可測得其體外總抗氧化能力，實驗按濃度梯度進行，每個濃度樣品做兩次平行試驗。同時按照同樣方法做一組抗壞血酸（Vc）陽性對照，進行總抗氧化對比。實驗原理是：在酸性環境下，物質還原fe3+-三吡啶三吖嗪（fe3+-tPtZ）產生藍色的fe2+-tPtZ的能力反映了其總抗氧化能力，通過比色測定便得知其抗氧化能力高低。定義：樣品的抗氧化能力以達到同樣吸光度變化值（△a）所需的標準液離子濃度表示。標準曲線為y=0.6308x+0.1291，r2=0.9989。按液體體積計算，測定總抗氧化能力單位（U/ml）。計算公式：總抗氧化能力（U/ml）=1÷0.6308×（△a-0.1291）×V反總÷V樣=53.9×（△a-0.1291）÷cpr△a=a測定-a空白式中V反總：反應總體積，1.02ml；V樣：反應中樣品體積，0.03ml；cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml1.3.2羥自由基清除能力測定將PPd、PPt、(24r)-ocotillol、(24s)-ocotillol、(25r)-HPd和(25s)-HPd分別配制成3.0mg/ml母液，配制Vc陽性對照母液3.0mg/ml。再將上述母液分別稀釋為1.5mg/ml，0.75mg/ml，0.375mg/ml的樣品，運用上海優選生物科技有限公司試劑盒（貨號：YX-c-a505）測定，詳細步驟按試劑盒說明書進行操作，配制為反應總體積為1.0ml，反應中樣品體積為0.25ml的反應液，濃度梯度平行測兩組，紫外下記錄各自吸收度。其原理是：H2o2/fe2+通過fenton反應產生羥自由基，將鄰二氮菲-fe2+水溶液中fe2+氧化為fe3+，導致536nm吸光度下降，樣品對536nm吸光度下降速率的抑制程度，反映了樣品清除羥自由基的能力。定義在37℃下60min反應，按照公式計算羥自由基清除率d%。羥自由基清除率d%=（od測定管-od對照管）÷（od空白管-od對照管）×100%

2結果與分析

2.1樣品分離結果經過皂苷分組，高溫堿降解，氧化環合分別得到六種人參皂苷元，分別為(20s)-原人參二醇(10g)、(20s)-原人參三醇(5.6g)、(20s,24r)-奧克梯隆(1.1g)、(20s,24s)-奧克梯隆(0.7g)、(20s,25r)-26-羥基二醇(0.8g)、(20s,25s)-26-羥基二醇(0.5g)。

2.2抗氧化試驗結果2.2.1總抗氧化能力不同濃度的六種人參皂苷總抗氧化能力由總抗氧化能力檢測試劑盒測定，結果見表1和圖2。由表1和圖1可知，與陽性對照抗壞血酸相比，六種人參皂苷均有不同程度的抗氧化活性，并且在0.075mg/ml~0.3mg/ml濃度范圍內有一定的濃度依賴性。同濃度下的六種人參皂苷的體外總抗氧化活性大小依次為PPd>PPt>(25s)-HPd>(24r)-ocotillol>(24s)-ocotillol>(25r)-HPd,PPd總抗氧化能力最高，(25r)-HPd最低。2.2.2羥自由基清除能力不同濃度的六種人參皂苷羥自由基清除能力見表2和圖3。與陽性對照抗壞血酸相比，六種人參皂苷均有較強的羥自由基清除能力。在0.075mg/ml~0.3mg/ml的濃度范圍內，六種人參皂苷與Vc的羥自由基清除能力均具有濃度依賴性，隨著濃度的升高，其能力也逐漸提高。羥自由基清除能力在六種人參皂苷上區別表現明顯，大小依次為：PPd>PPt>(25s)-HPd>(24r)-ocotillol>(24s)-ocotillol>(25r)-HPd由總體羥自由基清除率數據可以看出(24s)-ocotillol的羥自由基清除能力隨濃度變化影響較大。

3結論與討論

人參皂苷藥理作用包括對神經系統的作用，對心血管系統的作用以及抗腫瘤等方面。卞俊等[7]發現人參皂苷可通過減少淀粉樣多肽的形成，來抑制微管相關蛋白磷酸化，從而減少腦內老年斑的形成及神經纖維纏結，提高神經的可塑性，對老年癡呆、阿爾茨海默病的治療提供了藥理基礎。李娜等[8]在研究人參皂苷rg1時發現人參皂苷通過抗氧化應激等活動，可以保護腦組織黑質多巴胺能神經元，進而在治療帕金森病上發揮藥理作用。陳兆耀等[9]通過研究人參皂苷闡述了人參皂苷在提高記憶力方面的藥理基礎。杜依楚[10]在研究人參皂苷rg1時，得出結論人參皂苷通過促進神經遞質的釋放，使神經元之間的信息傳遞加快，從而解釋了人參皂苷對記憶能力提高的原理。丁艷芬等[11]的實驗結果表明人參皂苷可以提高機體抗氧化應激能力。張宏偉等[12]在研究人參皂苷rb3中發表人參皂苷可以增強腦組織的能量代謝和抗氧化作用，可以保護腦組織的結論。另外，西洋參莖葉皂苷具有抗失血性休克及對心臟的保護作用。關利新等[13]在用鈣離子熒光指示劑fura-2/aM檢測西洋參莖葉皂苷對大鼠心肌細胞ca2+內流的影響的試驗中，得出西洋參莖葉皂苷對心肌細胞的電壓依賴性鈣通道有阻斷作用的結論。stavroPM等[14]發現西洋參有中等強度的降血壓作用。shaoZH等[15]的研究表明，西洋參果提取物可以清除心肌細胞氧自由基。XieJt等[16]的實驗結果表明，人參皂苷re對H2o2和oH-有清除作用，從而起到抗雞心肌細胞氧化的作用。在抗腫瘤方面，黃海英等[17]對人參皂苷rg1的藥理活性研究實驗表明，人參皂苷可以通過多種途徑破壞線粒體膜，釋放與凋亡相關的因子，阻礙細胞周期，誘導細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用。楊逸等[18]同樣發現了人參皂苷通過影響細胞周期來抑制腫瘤細胞增殖。YuntK等[19]對人參皂苷rh2的抗腫瘤活性進行研究，結果表明人參皂苷對腫瘤細胞的生長有抑制作用。WangcZ等[20]證明人參皂苷是抗癌活性成分。程汝濱等[21]在人參皂苷rh2的抗腫瘤轉移的功能研究中提出核轉錄因子-κB、絲裂原活化蛋白激酶、細胞外調節蛋白激酶和轉化生長因子-β等信號通路均與腫瘤的發生和發展存在一定關系。YoonJH等[22]研究發現，人參皂苷可調控核轉錄因子-κB、絲裂原活化蛋白激酶、細胞外調節蛋白激酶和轉化生長因子-β等信號通路，來抑制腫瘤細胞的轉移。人參皂苷還可以提高小鼠血清中的抗體igG，激活th1和th2細胞因子的生成釋放，調節機體免疫功能，影響腫瘤細胞的轉移和生長等[23]。人參皂苷大多具有抗氧化作用，并且已經廣泛應用于食品、藥品、化妝品和保健品等領域。在生命過程中生物體不斷產生有很強生物活性的氧自由基，過量自由基對會造成細胞損傷，張振明等[24]研究表明抗氧劑可直接清除過剩自由基或者可以提高體內抗氧化系統功能，從而起到抗氧化的作用，保護機體細胞不受皮損。Huangd等[25]提出了體外抗氧化實驗方法的基礎理論，即依靠氫原子轉移和電子轉移機理。人參皂苷類的抗氧化作用可能是其延緩衰老，抗動脈粥樣硬化，抗缺血再灌注損傷等藥理作用的共同機制。本文從西洋參總皂苷中制備出六種人參皂苷，(20s)-原人參二醇、(20s)-原人參三醇、(20s,24r)-奧克梯隆、(20s，24s)-奧克梯隆、(20s,25r)-26-羥基二醇、(20s,25s)-26-羥基二醇，經過體外總抗氧化研究實驗表明，六種人參皂苷均具有一定的體外抗氧化活性。由兩個實驗對比看出，抑制羥自由基能力比總抗氧化能力強。在本研究的濃度范圍內，六種人參皂苷的抗氧化能力呈劑量效應。當然，也存在一些不足，如六種人參皂苷制備過程中產率不高，且體外抗氧化活性能力數據并不明顯，因而在制備工藝方面還有待進一步研究，另外6種皂苷自由基清除能力較弱，對氧自由基本身影響較少，推斷可能是通過提高體內sod、cat等抗氧化酶的活性來增強機體的抗氧化系統功能，因此，還需進行體內抗氧化活性實驗研究，進一步為人參皂苷的藥理作用和機制探討提供理論依據和基礎。

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作者：張馨妍 洪新悅 高連叢 馬瑩慧 韓柳 單位：吉林醫藥學院藥學院