本站小編為你精心準備了人腎近曲小管上皮細胞凋亡及調控參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《安徽醫科大學學報》2016年第四期

摘要

目的研究高糖誘導人腎近曲小管上皮細胞凋亡及其調控機制。方法以人腎近曲小管上皮細胞株HK2為研究對象，隨機分為對照組、高糖組、甘露醇組。MTT、流式細胞術觀察細胞的增殖和凋亡狀況；ELISA法檢測細胞內Caspase的活性；Westernblot法分析B淋巴細胞瘤2（Bcl2）及Caspase家族蛋白的表達變化。結果與對照組比較，高糖組能抑制HK2細胞的體外增殖，下調抑制凋亡作用的蛋白Bcl2表達，上調促凋亡作用的蛋白Bax、Bak表達（P＜005）；流式細胞術顯示HK2細胞周期有明顯的變化，且隨葡萄糖濃度的升高中期凋亡和末期凋亡所占的比例明顯上升（P＜001），并且Caspase酶原降解及活性表達也呈上升趨勢（P＜001）。結論高糖能抑制HK2細胞體外增殖并誘導其凋亡，其機制可能是通過Bcl2及Caspase家族調控HK2細胞的凋亡。

關鍵詞

高糖；HK2；凋亡；表達

細胞凋亡是生理性過程，不同于細胞壞死；凋亡細胞能產生吞噬和清除碎片的凋亡小體，避免周圍環境中細胞損害，維持內環境穩定［1］。糖尿病腎病（diabeticnephropathy，DN）發病機制復雜，DN早期，腎臟通過細胞凋亡等應急反應來清除過度增殖的內皮細胞，維持內環境穩定；DN晚期，隨著腎功能障礙，內環境穩態破壞，細胞凋亡過度，致使腎損害也加劇［2－3］。了解和干預腎小管內皮細胞凋亡有助于延緩DN進展。該研究采用體外培養人腎近曲小管上皮細胞株HK2細胞，分析高糖壞境下HK2細胞的增殖和凋亡狀況、B淋巴細胞瘤2（Bcelllymphoma2，Bcl2）及Caspase家族蛋白表達的變化，并進一步探討這些作用可能的分子調控機制。

1材料與方法

1．1材料低糖（55mmol／L）DMEM（美國Gibico公司）；Dglucose、醫用甘露醇（北京國藥集團公司）；Gibco原裝小牛血清（北京索萊寶科技有限公司）；HK2由中國科學技術大學生命科學院贈送，液氮保存；AnnexinVFITC（安徽碧云天生物試劑公司）；一抗actin、Caspase3、Caspase9、Bcl2、Bax、Bak、Caspase7（美國SantaCruz公司）；MTT（美國Sigma公司）；二抗（美國Pierce公司）。

1．2方法

1．2．1細胞培養和分組液氮取出HK2細胞，37℃水浴解凍，迅速接種于含10％小牛血清低糖DMEM（葡萄糖濃度55mmol／L），37℃、5％CO2飽和濕度的細胞培養箱中。胰酶消化傳代，備用。分組：對照組（葡萄糖濃度為55mmol／L）、高糖組（葡萄糖濃度分別為25、40mmol／L）和甘露醇組（葡萄糖濃度55mmol／L＋甘露醇濃度分別為195、345mmol／L）。

1．2．2MTT法檢測細胞增殖取生長旺盛的HK2細胞，胰酶消化，按121分組，MTT實驗嚴格按照前期報道［4］操作，實驗重復3次。

1．2．3AnnexinVFITC分析細胞凋亡取對數期生長的HK2細胞，胰酶消化傳代，制成細胞懸液，取合適的量平均接種于6孔板，次日按121分組，37℃刺激48h，各組胰酶消化制成約1×106個／ml細胞懸液。400μlAnnexinV結合液重懸，加入5μlAnnexinVFITC染色液，2～8℃避光孵育15min。4℃冷凍離心5min（10000r／min），去除上清液，再用400μlAnnexinV結合液重懸，10μl／孔PI染色液，震動器輕輕混勻；錫箔紙包裹置冰上孵育5min，然后上機檢測。

1．2．4Caspase蛋白酶原活性檢測原理：依據ELISA抗原抗體結合的原理，細胞內活性的Caspase7、Caspase3、Caspase9能在體外與相應的酶結合，催化底物顯色反應，通過吸光度（opticaldensity，OD）值OD405來間接反應Caspase7、Caspase3、Caspase9的活性。取對數期生長的HK2細胞，按123步驟操作，分組后置于培養箱連續刺激2d，胰酶消化，冷凍離心5min（10000r／min），按照ELISA法操作，依次加入酶、底物、酶標儀檢測，實驗重復3次。

1．2．5Westernblot法檢測提取總蛋白：按121分組批量培養，刺激48h后，棄去原液并用PBS洗去殘留液體，置冰上，每瓶加裂解液150μl充分裂解，細胞刮子收集細胞，低溫冷凍離心5min（10000r／min），上清液置于－80℃備用，BCA測定蛋白濃度，每組加入濃縮蛋白上樣緩沖液，水浴煮沸，分裝備用，置于－20℃保存。配制125％SDSPAGE，微量加樣針上樣，先用40～50V電泳濃縮膠，100V電泳分離膠，100mA冰浴轉膜，伊利脫脂牛奶封閉，PBS洗膜，置于一抗為Bcl2（1∶400），Caspase7（1∶1000），Bak（1∶1000），Bax（1∶300），Caspase3（1∶2000），Caspase9（1∶800），actin（1∶1000），4℃過夜。相應二抗分別為山羊抗小鼠（1∶1500），山羊抗鼠（1∶1500），山羊抗兔（1∶1000），山羊抗鼠（1∶1000），山羊抗鼠（1∶1000），山羊抗兔（1∶1000），山羊抗小鼠（1∶4000），37℃孵育2h，PBS洗膜3次，暗室內膠片顯影、定影，重復實驗3次。結果進行統計學分析。Westernblot條帶的灰度值用ImagePro45分析軟件測定。

1．3統計學處理采用SPSS190軟件進行統計學單因素方差分析，數據用珋x±s表示。組間計量資料用方差分析。

2結果

2．1高糖對HK2細胞的體外增殖的影響MTT結果采用單因素方差分析進行主體間效應檢測，顯示差異有統計學意義（F＝11204，P＜001）。組間兩兩比較顯示，與對照組比較，高糖組（25、40mmol／L）的OD值依次降低，且糖濃度為40mmol／L抑制率達266％（P＜005，P＜001）；而甘露醇組與對照組比較，差異無統計學意義，表明體外高糖能抑制HK2細胞的體外增殖，與高晶體滲透壓無關。見表1。

2．2高糖對HK2細胞凋亡的影響結果采用單因素方差分析進行主體間效應檢測，差異有統計學意義（F＝8254，P＜001）。組間兩兩比較顯示：與對照組（99％）比較，高糖組（圖1B、1C）中期凋亡與末期凋亡所占的比例明顯升高，并且末期凋亡所占的比例隨著葡萄糖濃度的升高而升高；從圖1D、1E中可以觀察到甘露醇對細胞的凋亡影響不明顯。提示高糖能誘導HK2細胞凋亡，與高晶體滲透壓無關。見圖1、表2。

2．3高糖對Caspase蛋白酶原活性的影響單因素方差分析顯示高糖能夠增強Caspase7、Caspase3、Caspase9活性（F＝7143、5581、7432，P＜001）。組間兩兩比較顯示：與對照組比較，高糖組Caspase7、Caspase3、Caspase9活性呈上升趨勢，但甘露醇組活性沒有明顯變化。見圖2。

2．4高糖對Bcl2及Caspase蛋白酶原家族蛋白表達的影響單因素方差分析顯示高糖上調Bak、bax、cleavedCaspase9、cleavedCaspase3、cleavedCaspase7蛋白表達（F＝2741、4754、3722、41772547，P＜001）；下調Bcl2蛋白表達（F＝3314）。組間兩兩比較顯示：與對照組比較，Bcl2家族Bcl2蛋白表達量有所下降，Bak、Bax蛋白表達量顯著上升，且Bax／Bcl2的比值也呈上升趨勢。另外剪切后的Caspase蛋白酶原家族cleavedCaspase9、cleavedCaspase3、cleavedCaspase7蛋白表達明顯增加，見圖3。

3討論

DN是糖尿病重要并發癥之一，其基本病理特征主要表現為腎小球細胞外基質聚集與降解紊亂，導致腎小球病態增生、基底膜增厚和動脈硬化等，這些改變嚴重影響腎小管的營養供應，誘發上皮細胞程序性凋亡，從而導致腎間質纖維化［5］。國外相關報道［6］證實終末期腎病腎小球損傷多數從腎小球上皮細胞（足細胞）損傷開始；在糖尿病的早期，長期處于高糖環境下的細胞微環境發生改變，導致腎小球超過濾、誘發氧化應激、糖化終產物堆積、蛋白激酶C的激活、多元醇化、轉化生長因子的過表達和炎癥等，這些因素致使腎小管基底膜增厚，養分供應受阻，引起腎小管上皮細胞萎縮，導致腎衰竭。因此干預腎小管上皮細胞凋亡，維持上皮細胞活性，能有效的減緩腎臟的衰竭［5］。體內長期高血糖容易導致上皮、內皮細胞損傷和功能障礙，從而誘發多種疾病，如2型糖尿病等；因此，控制血糖，并通過調節細胞增殖和凋亡修復損傷的細胞有重要的臨床意義［7－8］。本研究模擬體內高糖環境，選取穩定性較好的人腎近曲小管上皮細胞株HK2進行體外培養。作為維持近曲小管功能的上皮細胞，HK2細胞的功能障礙在DN的發生發展中扮演著重要角色。實驗表明高糖刺激48h后HK2細胞的增殖抑制，且出現細胞凋亡現象。

Bcl2家族和Caspase共同參與調控細胞凋亡［9－10］。Bcl2家族通過調控Bcl2與Bax、Bak之間的比例，改變線粒體膜的通透性釋放細胞色素C等促凋亡蛋白［11－12］，誘導細胞凋亡。而Caspase家族分工協作，Caspase9感受線粒體發出的死亡信號；Caspase3屬于凋亡效應子，能直接引起細胞凋亡；Caspase7能促使ROS表達，誘導內質網應激，參與細胞凋亡［13－15］。本實驗Westernblot結果表明HK2細胞內Bcl2家族和Caspase家族均被激活，表現為Bcl2蛋白表達量下降，Bak、Bax蛋白表達量上升，且Bax／Bcl2的比值也呈上升趨勢。另外Caspase蛋白酶原家族Caspase9、Caspase3、Caspase7酶原降解及活性表達也呈上升趨勢。推測高糖可能是通過某種途徑激活Bcl2家族，釋放細胞色素C，引起Caspase酶原降解，活化Caspase家族啟動級連反應，誘導HK2細胞發生凋亡。詳細機制有待進一步研究。

作者：袁育臖 段惠芳 胡志堅 汪淵 單位：九江學院附屬醫院 檢驗科 安徽省／省部共建教育部重要遺傳病基因資源利用重點實驗室