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《國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》2014年第十二期

1資料與方法

1．1方法

1．1．1分離培養(yǎng)hBMSCs在志愿者髂前上棘抽取骨髓10mL。采集的骨髓用生理鹽水1∶1稀釋，密度為1．077g／L的淋巴細(xì)胞分離液2000r／min離心15min，收集白膜層，生理鹽水漂洗2次。以含10％FBS的L－DMEM作為完全培養(yǎng)液，以一定密度接種于75mL培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3d后換液去除非貼壁細(xì)胞，以后每2～3d換液1次，待細(xì)胞達(dá)80％融合時(shí)，用0．25％胰酶＋0．02％ED－TA消化，以1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1．1．2流式檢測hBMSCs表型hBMSCs用0．25％胰酶＋0．02％EDTA消化，1000r／min離心5min，生理鹽水洗滌，制備成1×106／mL單細(xì)胞懸液，分別加入熒光標(biāo)記的鼠抗人CD34、CD29、CD105抗體，設(shè)置空白對照，避光冰育30min，生理鹽水洗滌3次后重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。

1．1．3鑒定hBMSCs多向分化潛能以4×103／cm2密度將第3代hBMSCs接種于6孔板，每孔2mL。（1）成脂誘導(dǎo)及鑒定：細(xì)胞達(dá)到完全融合后4d，實(shí)驗(yàn)組加入脂肪誘導(dǎo)液（H－DMEM，10％FCS，0．5mmol／LIBMX，10μg／mL牛胰島素，0．2mmol／Lindomethacin，1μmol／L地塞米松）誘導(dǎo)3d，再用脂肪保持液（H－DMEM，10μg／mL牛胰島素，10％FCS）處理1d，循環(huán)3次，再用脂肪保持液處理2d。對照組加入含10％FCS的H－DMEM，每3天換液1次。2周后油紅O染色鑒定。（2）成骨誘導(dǎo)及鑒定：細(xì)胞達(dá)到60％～70％融合后，實(shí)驗(yàn)組加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液（OS，含1×10－7mol／L地塞米松，10mmol／L甘油磷酸鈉，50g／mL維生素C），對照組加入L－DMEM完全培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中，每2天換液1次，第21天終止誘導(dǎo)。茜素紅S染色鑒定。

1．1．4分組處理hBMSCs采用0．25％胰酶＋0．02％EDTA消化hBMSCs，用不同輸注液制備單細(xì)胞懸液。根據(jù)輸注液不同分為生理鹽水組（9g／L氯化鈉注射液）、糖鹽組（50g／L葡萄糖氯化鈉注射液）、清蛋白組（含5％人血清蛋白的氯化鈉注射液）。分別在4℃和25℃溫度條件下置于不同時(shí)間點(diǎn)（0．5、1．0、2．0、4．0，6．0h）后進(jìn)行以下檢測。（1）取90μL細(xì)胞懸液與10μL胎盤藍(lán)混勻，3min內(nèi)計(jì)數(shù)活細(xì)胞（未染色）和死細(xì)胞（染色），測定細(xì)胞存活率。（2）另取1×106／mL細(xì)胞行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型CD34、CD29、CD105。（3）再將不同分組細(xì)胞懸液，1000r／min離心5min，采用含10％FBS的L－DMEM作為完全培養(yǎng)液，以1×103／mL密度接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d。采用CCK－8在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定450nm各孔波長吸光度（A）值，以時(shí)間為橫軸，A值為縱軸繪制生長曲線。

1．2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17．0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用x±s表示。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組均數(shù)間比較，采用單因素方差分析進(jìn)行多組均數(shù)間比較，采用LSD最小顯著差數(shù)法進(jìn)行均數(shù)間兩兩比較。P＜0．05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1hBMSCs形態(tài)觀察原代hBMSCs貼壁后，呈圓形，散在分布。3d后完全換液，去除未貼壁細(xì)胞，可見少量分散短梭形貼壁細(xì)胞。第14天時(shí)，貼壁細(xì)胞融合成單層，細(xì)胞排列有明顯方向性，呈漩渦狀。見圖。

2．2hBMSCs的表型流式檢測第3代hBMSCs的表型發(fā)現(xiàn)，CD105陽性率98．7％，CD29陽性率97．7％，表達(dá)率極高；CD34陽性率為2．9％，表達(dá)呈陰性。

2．3hBMSCs分化能力鑒定hBMSCs成脂誘導(dǎo)2周后，光學(xué)顯微鏡下可見大量融合成串珠狀的圓形脂滴。油紅O染色可見被染成橙紅色的脂滴，顯示分離的hBMSCs可被誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞分化。成骨誘導(dǎo)3周，細(xì)胞逐漸融合，失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，14d左右出現(xiàn)明顯鈣結(jié)節(jié)，茜素紅S染色后可見散在大量橘紅色鈣結(jié)節(jié)，顯示培養(yǎng)的hBMSCs可被誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化。

2．4hBMSCs存活率檢測在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0．5、1．0、2．0、4．0、6．0h）對保存在25℃、4℃的3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率檢測，結(jié)果見表1～2。結(jié)果顯示，糖鹽組細(xì)胞存活率最低，25℃保存4．0h時(shí)只有約10％細(xì)胞存活；而清蛋白組細(xì)胞存活率最高，25℃保存2．0h時(shí)清蛋白組細(xì)胞存活率仍可達(dá)90％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。25℃和4℃條件下，保存0．5h時(shí)，生理鹽水組及清蛋白組細(xì)胞存活率都超過90％，隨著保存時(shí)間延長，各組細(xì)胞存活率逐漸下降。

2．5不同分組細(xì)胞表型檢測25℃和4℃條件下，在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0．5、1．0、2．0、4．0、6．0h）對3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞表型檢測，結(jié)果見表3～5。結(jié)果表明，不同輸注液、保存溫度及保存時(shí)間對細(xì)胞表型影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。

2．6細(xì)胞生長曲線測定將不同分組處理后的細(xì)胞，采用L－DMEM完全培養(yǎng)液重新接種培養(yǎng)，檢測細(xì)胞增殖能力，結(jié)果見圖2（見《國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站“論文附件”）。50g／L葡萄糖氯化鈉注射液組保存的細(xì)胞增殖能力最差，保存4h后細(xì)胞失去貼壁和生長能力（無細(xì)胞貼壁無法完成生長曲線）。5％人血清清蛋白氯化鈉注射液組細(xì)胞增殖能力比9g／L氯化鈉注射液組細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。同一組細(xì)胞4℃條件下不同時(shí)間點(diǎn)的增殖能力比25℃條件下強(qiáng)。隨著保存時(shí)間延長，各組細(xì)胞增殖能力逐漸下降。

3討論

hBMSCs是來源于骨髓的間質(zhì)干細(xì)胞，不僅能分化成肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞［4］、血管內(nèi)皮細(xì)胞［5］、不同類型的皮膚細(xì)胞［6］、神經(jīng)樣［7］細(xì)胞，還具有免疫調(diào)節(jié)、炎癥趨化等特性，使其在肝臟疾病、血管外科、燒傷整形外科及神經(jīng)損傷等疾病治療中發(fā)揮越來越重要的作用。干細(xì)胞注射液從實(shí)驗(yàn)室制備到運(yùn)送至病房回輸給患者具有一定時(shí)空距離，特別是隨著異地移植病例的增多，如何有效地保存干細(xì)胞注射液，對于細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用非常重要。目前相關(guān)研究更多集中于將干細(xì)胞冷凍于－80℃或液氮等進(jìn)行長期保存的探討［8－9］，有關(guān)短時(shí)保存條件對干細(xì)胞生存和生長影響的研究不多。本實(shí)驗(yàn)探討了幾種臨床常用注射液在不同溫度下短時(shí)保存干細(xì)胞對細(xì)胞存活和增殖能力等狀況的影響。形態(tài)學(xué)觀察顯示，培養(yǎng)的細(xì)胞呈均一長梭形，輻射狀生長；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型顯示CD34表達(dá)陰性，CD29、CD105表達(dá)陽性；成脂誘導(dǎo)后出現(xiàn)大量脂滴，成骨誘導(dǎo)后出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)，表明該細(xì)胞確為hBMSCs。

通過3種注射液比較結(jié)果顯示，在同等溫度和時(shí)間條件下，50g／L葡萄糖氯化鈉注射液對細(xì)胞活力影響最大，可能與細(xì)胞利用葡萄糖產(chǎn)生大量乳酸加重細(xì)胞損傷有關(guān)；能為細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)的5％人血清清蛋白氯化鈉注射液對細(xì)胞活力影響最小?？紤]到輸注液對細(xì)胞活力的影響，建議使用含5％人血清清蛋白氯化鈉注射液作為輸注液，如患者不宜使用，可選擇使用9g／L氯化鈉注射液，但不宜使用50g／L葡萄糖氯化鈉注射液作為輸注液。2種溫度比較結(jié)果顯示，4℃保存對細(xì)胞增殖能力的影響更小，可能相對低溫可以降低細(xì)胞代謝速度，延緩其凋亡。用于臨床治療的hBMSCs注射液室溫保存最好不要超過1．0h，不能及時(shí)回輸時(shí)需存放在4℃，但也不要超過2．0h。將干細(xì)胞保存在上述幾種注射液中，隨著保存時(shí)間延長，其存活率、貼壁及增殖能力均顯著下降，可能與注射液營養(yǎng)成分及生長因子等細(xì)胞生長所需要的條件缺乏有關(guān)。不同輸注液、保存溫度及保存時(shí)間對細(xì)胞表型影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），表明不同保存條件不會(huì)引起細(xì)胞表面物質(zhì)的脫落，僅引起細(xì)胞凋亡。綜上所述，臨床常用注射液對細(xì)胞活力影響較大，hBM－SCs一旦制備成細(xì)胞注射液，應(yīng)盡可能保存在4℃，及時(shí)運(yùn)送至臨床回輸給患者，這樣才能保持細(xì)胞活力，滿足臨床需要。

作者：陳京季明芳李曉玲方慧云余元龍程偉民單位：中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院腫瘤研究所