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《臨床檢驗雜志》2014年第六期

1自身免疫性肝病的抗體診斷指標

1．1PBC2009年AASLD與2010年歐洲肝病研究學會(EuropeanAssociationFortheStudyoftheLiver，EASL)推薦的PBC診斷標準［6-7］:(1)存在膽汁淤積的生化學證據，主要是堿性磷酸酶(ALP)升高;(2)抗線粒體抗體(AMA)陽性;(3)組織學上存在非化膿性破壞性膽管炎以及小葉間膽管破壞的表現。滿足以上3條標準中的兩條即可診斷PBC。1965年Walker等用IIF技術發現PBC患者血清中存在AMA，是PBC的標志性自身抗體，特別是AMA-M2亞型陽性對PBC的診斷具有高度敏感性和特異性，其陽性率達90%～95%。AMA-M2亞型的靶抗原為線粒體上2-氧酸脫氫酶復合體(2-OADC)的一些成分。2-OADC包括丙酮酸脫氫酶復合體E2亞單位(PDC-E2)、支鏈二酮酸脫氫酶復合體E2亞單位(BCOADC-E2)、2-酮戊二酸脫氫酶復合體E2亞單位(OGDC-E2)以及二氫硫辛酰胺脫氫酶結合蛋白(E3BP)，最常見的反應是針對PDC-E2。AMA陰性也不能完全排除PBC的患病可能，約5%～10%的患者中AMA陰性，但其臨床表現與AMA陽性患者相同。此外，研究表明AMA與疾病的進展不相關［8］。除了AMA，50%左右的PBC患者也能檢測到ANA陽性，其常見熒光模式包括斑點型、多核點型、核周型和抗著絲粒型。一般認為，多核點型ANA和核周型ANA具有PBC疾病相關性。多核點型ANA的靶抗原是核體復合物，主要包括Sp100、早幼粒細胞性白血病(PML)抗原、微小泛素相關修飾因子(SUMO)以及新近確定的Sp140。核周型ANA的靶抗原是核孔復合物和核膜，其中，核孔復合物主要包括gp210和p62，核膜蛋白是核纖層蛋白B受體(LBR)。抗gp210、抗Sp100抗體可以作為判斷預后好壞的一種特異性標志物［9］。

1．2PSCAASLD于2010年的《PSC診療指南》［10］中建議:出現ALP和γ-谷氨酰基轉移酶(GGT)升高等膽汁淤積生化特征，膽管造影檢查包括磁共振膽管造影(MRC)、內鏡逆行膽管造影(ERC)、經皮肝穿刺膽管造影(PTC)等顯示具有典型的多灶性膽管狹窄和節段性擴張的膽管改變，并除外繼發性硬化性膽管炎，則可以診斷為PSC。PSC組織學改變為大、中型膽管彌漫性炎癥和膽管周圍“洋蔥波”樣纖維化，膽管閉塞、膽汁淤積、膽管減少。PSC患者會出現高球蛋白(IgG、IgM)血癥，血清中ALT、AST、膽紅素上升。大部分PSC患者非典型pANCA陽性。但PBC和AIH患者中也有非典型pANCA的出現，因此pANCA陽性不能作為PSC的特異性確診指標［11］。

2自身免疫性肝病的抗體檢測技術

2．1IIF法IIF使用具有較大核仁細胞的組織或者HEp-2細胞作為抗原來源，用于細胞內抗原定位或相應抗體(如ANA、AMA、ASMA、抗LKM-1等)檢測，是研究自身免疫性肝病使用最為廣泛的方法。該方法能夠區別不同熒光類型，特異性較高。但手工操作及人工判讀結果均存在主觀誤差。雖然某些IIF自動稀釋系統和判讀系統已經上市，但其標準化和自動化進程仍然落后于其他實驗室技術。一些研究者認為免疫熒光技術已經過時，可以用酶免疫分析或其他試驗技術來取代［12］。但是，因為其抗體譜全面和能夠發現未知抗體，IIF仍然是掃描自身免疫疾病抗體ANA的推薦方法。ANA由于包括了多種針對不同抗原的抗體，底物特異性相對較差。IIF實驗主要基于手工操作，結果判斷人為因素較大，容易造成結果判斷的個人差異和室間差異。由于ANA缺少疾病特異性，將來會更多地應用于常規普查。對于特異疾病的診斷，ANA的檢測會逐步被針對特異抗核蛋白或DNA的抗體檢測所替代。

2．2ELISA20世紀90年代后期，開發了商業ANA酶免疫分析(EIA)法檢測試劑盒，但因未獲得與IIF相同的檢測結果而未被廣泛使用。近年新型商品ANA-EIA試劑盒通過使用含有純化或重組抗原的HEp-2細胞核提取物作為底物，達到了很高的敏感性和較高陰性預測值。針對AMA檢測的ELISA方法，早期以PDC-E2為底物。為提高AMA-M2檢測的敏感性，一些AMA檢測方法加入以丙酮酸脫氧化氫酶復合物中3個脫氫酶的C端連接組成的重組蛋白質作為底物。ELISA法與IIF相比，以吸光度(A)值代替滴度，以特異性抗體取代熒光模式，酶標記試劑相對穩定，且無放射性危害，相對而言，結果更客觀，操作快捷、易于自動化［13］。目前臨床檢測自身免疫肝病抗體的ELISA和免疫印跡法(膜條)的產品之間存在著較大的底物差異，這可能是不同產品之間結果出現差異的原因之一。

2．3免疫印跡膜條法免疫印跡膜條法是通過將特定抗原固化在膜條的特定位置，以待檢血清或血漿樣品為第一抗體的免疫印跡檢測方法。膜條上的抗原多為重組蛋白質，經親和層析分離純化，部分抗原為合成多肽。因為抗原純度較高，免疫反應特異性也較強。由于可在膜條的不同位置分別固化不同特定抗原，可同時實現對多種自身抗體的檢測，結果判斷也較為簡單。目前此方法的大部分實驗過程可實現儀器操作，結果的判定也可根據不同公司研發的軟件進行自動判斷。基于該方法的自身免疫肝病抗體檢測膜條已廣泛被國內臨床實驗室所采用。2．4xMAP微珠法自Luminex公司研制出基于兩種熒光組合的微珠技術(xMAP)以來，其在臨床檢測上的應用受到越來越多的重視。微珠制備是通過采用

橘紅兩色熒光素按比例混合于聚苯乙烯微珠中，產生100種可通過激光識別的熒光微珠。針對不同的熒光微珠耦聯特定抗原，結合流式計數，可實現同時針對多種自身抗體的檢測。Rouquete等［14］采用這一方法對9種核抗原耦聯，實現了對9種不同抗核抗體的檢測。目前已有多家公司采用這一技術研發了針對自身免疫性肝病抗體的檢測產品。采用xMAP微珠法，由于同時對多種抗體進行分析，抗原抗體交叉反應所造成的假陰性和假陽性結果會比采用單一抗原的ELISA或分別點樣的膜條要高。但由于抗原抗體結合過程是在懸液中進行的，比之ELISA和膜條方法，xMAP微珠法的抗原抗體結合更加有效。由于xMAP微珠法檢測指標組合的靈活性和多抗體的同時檢測，這一方法將會被更多的臨床實驗室采用。

3自身免疫性肝病抗體檢測存在的問題

自身免疫性肝病抗體的檢測目前主要存在兩大問題。其一就是抗體檢測底物的非均一性。以AMA-M2檢測產品為例，現有ELISA和膜條印跡法的AMA-M2抗原有組織提取物、PDC-E2全長重組蛋白、PDC-E2的N端重組蛋白、PDC-E2/BCOADC-E2/OGDC-E2N端三聯體融合重組蛋白和PDC-E2/BCOADC-E2/OGDC-E2全長重組蛋白混合物。抗gp210抗體檢測采用的抗原有來自大腸埃希菌的重組蛋白、昆蟲細胞sf9表達的重組蛋白和合成多肽。因抗原不同，檢測敏感性和檢出率會產生較大差別。自身免疫性肝病自身抗體檢測存在的另一主要問題就是缺少統一的檢測質控品和陽性對照。1982年美國風濕病協會和美國疾病控制中心通過收集ANA陽性患者血清，建立了5個不同的ANA檢測標準品，并在此基礎上進一步發展為10個不同的ANA檢測血清標準品。這10個血清標準品包括不同的ANA特異性(非變性DNA，SS-A，SS-B，U1-RNP，Sm，Sc1-70和Jo-1)［15］。1988年世界衛生組織和國際免疫學協會聯盟(IUIS)開始從患者血清制備了3種ANA標準品，包括WHO66/233(IgG類ANA)和W0/80(抗雙鏈DNA抗體)。目前歐盟的相關機構亦有將少量自身免疫抗體陽性的患者血清用作標準品。所有這些標準品的來源均來自于個別患者血清，數量有限，無法提供給臨床實驗室用于常規實驗室質控。由于缺少統一的標準品和校正品，目前市場上基于ELISA的自身免疫抗體檢測產品的標準曲線的校正單純基于采用調整第二抗體(抗人IgG類抗體)來進行。產品本身的校正各公司均采用任意單位(由于無標準品)，造成結果無法比較。多數試劑盒的陽性對照無明確說明，其來源和性質未知。

4結語

自身免疫性肝病是一類慢性進展性疾病，嚴重影響患者肝臟功能，目前不可治愈，因此早期診斷和藥物干預對控制疾病的發展極為重要。相關自身抗體的檢查在自身免疫性肝病的診斷上尤為重要。今后幾年的發展重點將會針對相關抗體檢測的標準化研究和檢測質控品的開發。

作者：劉向東單位：東南大學生命科學研究院