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摘要：目的探討熒光定量聚合酶鏈反應（FQ－PCR）法檢測外周血mRNA中B細胞淋巴瘤／白血病－2基因（BCL－2）、細胞周期蛋白D1（CCND1）、黏蛋白1（MUC1）、原癌基因人類表皮生長因子受體2（HER－2）和人乳腺珠蛋白（hMAM）5種乳腺癌相關基因在乳腺癌診斷中的應用。方法FQ－PCR法測定50例健康女性體檢者（健康對照組）、92例良性乳腺疾病患者（良性乳腺疾病組）和196例乳腺癌患者（乳腺癌組）外周血mRNA中CCND1、BCL－2、MUC1、HER－2和hMAMmRNA的表達量。結果CCND1、BCL－2、MUC1、HER－2和hMAMmRNA表達水平在乳腺癌組顯著高于健康對照組和良性乳腺疾病組，差異有統計學意義（P＜0．05），其在健康對照組和良性乳腺疾病組間差異無統計學意義（P＞0．05）；5種基因mRNA在健康對照組和良性乳腺疾病組及乳腺癌組的Ⅰ期的陽性表達率差異無統計學意義（P＞0．05），而乳腺癌組的Ⅱ期和Ⅲ＋Ⅳ期則顯著高于健康對照組、良性乳腺疾病組和乳腺癌組的Ⅰ期組的陽性表達率，差異有統計學意義（P＜0．01）。結論采用FQ－PCR技術檢測乳腺癌mRNA時，應考慮到質量控制、mRNA水平和異質性、腫瘤不同階段等各個方面的因素，才能有效正確地將乳腺癌相關基因用于乳腺癌的診斷、治療和預后。

關鍵詞：熒光定量聚合酶鏈反應；BCL－2；CCND1；MUC1；HER－2；hMAM；乳腺癌

乳腺癌在女性惡性腫瘤發病率中排名第一，越來越多的乳腺癌相關基因成為研究熱點，人們期望通過對相關基因的檢測，及時準確地為乳腺癌診斷、治療和預后提供可靠的實驗室依據。熒光定量聚合酶鏈反應（FQ－PCR）法檢測乳腺癌外周血mRNA是近年來報道較多的研究方法，但是，縱觀國內外FQ－PCR對乳腺癌外周血mRNA的報道，其陽性率差別較大［1－2］，因此，本文采用FQ－PCR法檢測了目前研究得較多的，也是乳腺癌密切相關較為重要的5種基因———B細胞淋巴瘤／白血病－2基因（BCL－2）、細胞周期蛋白D1（CCND1）、黏蛋白1（MUC1）、原癌基因人類表皮生長因子受體2（HER－2）和人乳腺珠蛋白（hMAM）［3－6］在健康體檢者、良性乳腺疾病患者和乳腺癌患者的外周血mRNA表達，目的在于探討FQ－PCR檢測乳腺癌相關基因在外周血mRNA對乳腺癌診斷的臨床應用價值。

1資料與方法

1．1一般資料

選取本院健康女性體檢者50例作為健康對照組，年齡21～86歲，平均46．7歲。另選取本院門診和住院乳腺疾病患者288例，年齡21～87歲，平均45．3歲，經病理學確診，均為初診者。其中良性乳腺疾病患者（良性乳腺疾病組）92例，年齡23～79歲，平均43．6歲；脂肪瘤51例，纖維瘤41例，排除患其他腫瘤的可能性。乳腺癌患者（乳腺癌組）196例，平均年齡47．8歲（23～87歲），具體的臨床病理學特征見表1。乳腺癌的診斷標準參照《惡性腫瘤TNM分類法》和美國癌癥聯合委員會（AJCC）標準。所有患者均于手術前1周內取晨血5mL。

1．2試劑與儀器

逆轉錄反應體系、β－actin內參、FQ－PCR體系、7500SequenceDetector分析儀購自美國ABI公司；cDNA標準品由上海生工公司合成。

1．3方法

1．3．1FQ－PCR引物和探針

采用PE公司PrimerExpress軟件設計引物和探針，由上海生工公司合成。BCL－2正義引物5′－ACCCCCACTGAAAAAGATGA－3′，BCL－2反義引物5′－ATCTTCAAACCTCCATGATG－3′；CCND1正義引物5′CCTCCTCGCACTTCTGTTCCTCGCAGACCT－3′，CC－ND1反義引物5′－CCAGCATCCAGGTGGCGACGATCTTCCG－3′；MUC1正義引物5′－CGTCGTGGACATTGATGGTACC－3′，MUC1反義引物5′－GGTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA－3′；HER－2正義引物5′－GGCTCTCACACTGATAGACACC－3′，HER－2反義引物5′－TCCCCAGCAGCGGGAGCCCTTAC－3′；hMAM正義引物5′－GAGTTCATAGACGACAATGCC－3′，hMAM反義引物5′－CCGTAGTTGGTTTCTCACCAT－3′，β－actin正義引物5′－CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT－3′，β－actin反義引物5′－AGCACTGTGTTGGCGTACAG－3′。

1．3．2FQ－PCR

（1）采用異硫氰酸胍－酚－氯仿一步法提取細胞總RNA：取靜脈血5mL（1mg／mLED－TA抗凝），生理鹽水稀釋2～3倍，分離淋巴細胞。（2）cDNA合成：逆轉錄反應體系20μL，其中隨機引物200ng，RNasin20U，M－MLV反轉錄酶20U，5×逆轉錄反應緩沖液4μL，細胞總RNA1μg。42℃反應50min。（3）PCR：MgCl25mmol／L，反應體系逆轉錄產物5μL，寡聚核苷酸引物各為400nmol／L，dCTP、dATP和dGTP各200μmol／L，dUTP400μmol／L，10×緩沖液5μL，尿嘧啶N－糖基化酶（UNG）0．5U，探針150nmol／L，TaqDNA聚合酶1．25U。在7500SequenceDetector分析儀上測定標本中CCND1、BCL－2、MUC1、HER－2、hMAM和β－ac－tin含量。擴增參數為：50℃2．5min，95℃12min；94℃30s，66℃1min，42個循環。1．3．3陽性率的計算［7－8］應用2－ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達量（Ct為循環閾值）。ΔCt值＝目的基因Ct值－β－actin基因Ct值，以β－actin為內參；ΔΔCt＝乳腺癌組的ΔCt值－健康對照組的ΔCt值健康對照組的基因相對表達量為1．002±0．079，2－ΔΔCt值為乳腺癌組基因相對健康對照組基因表達的倍數，測定值以2－ΔΔCt＞2為表達陽性。

1．4統計學處理

采用SPSS16．0統計軟件進行統計分析，各組符合正態分布的計量資料比較采用方差分析，兩組間比較用采用LSD－t檢驗。取檢驗水準α＝0．05，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．1各組5種基因mRNA相對表達水平比較

健康對照組和良性乳腺疾病組間5種基因mRNA表達水平差異無統計學意義（P＞0．05），而乳腺癌組上述指標均高于其他兩組，差異有統計學意義（P＜0．01）。

2．2各組5種基因mRNA陽性表達情況比較

5種基因mRNA在健康對照組和良性乳腺疾病組及乳腺癌組的Ⅰ期的陽性表達率差異無統計學意義（P＞0．05），而乳腺癌組的Ⅱ期和Ⅲ＋Ⅳ期則顯著高于健康對照組和良性乳腺疾病組的陽性表達率，差異有統計學意義（P＜0．01）。2．35種基因mRNA對乳腺癌診斷性能評價5種基因對乳腺癌的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分析結果見表4，綜合評價各項指標，HER－2的靈敏度較高，BCL－2的特異性較強。

3討論

隨著對乳腺癌分子水平的深入研究，人們采用各種方法檢測不同來源乳腺癌相關基因的表達。比如，應用免疫細胞學法從蛋白質水平進行檢測，應用分子生物學方法從組織或外周血進行基因水平（DNA和RNA）檢測等。其中FQ－PCR是在常規PCR基礎上加入熒光標記探針進行核酸定量分析的先進方法，能同時進行擴增和檢測［9］，其具有靈敏度高、特異性較強、操作簡單、不需采用強誘變劑等優點，因而被廣泛應用于外周血中乳腺癌基因mRNA的檢測。BCL－2、CCND1、MUC1、HER－2、hMAM是乳腺癌常用的腫瘤標志物，也是近年來報道得較多的乳腺癌相關基因。筆者查閱資料發現，采用FQ－PCR檢測乳腺癌mRNA相關基因的報道存在陽性率差別較大的問題［8，10－11］。本研究檢測196例乳腺癌患者和92例良性乳腺疾病患者外周血hMAM表達率分別為22．0％和6．0％，而陳月鳳等［10］檢測47例乳腺癌和45例乳腺良性腫瘤外周血hMAM表達率分別為65．96％和42．22％，顏蘊文等［11］檢測40例乳腺癌患者hMAM陽性率55％，OBERMAYR等［12］檢測38例乳腺癌復發患者外周血中hMAM基因表達陽性率為38．7％。本研究檢測196例乳腺癌外周血MUC1陽性率為21．0％，STRATI等［9］檢測51例轉移性乳腺癌的外周血MUC1陽性率為45．1％，CHENG等［13］檢測34例轉移性乳腺癌外周血MUC1mRNA化療前后的陽性率分別為88．2％和70．6％。本研究檢測70例早期乳腺癌外周血HER－2陽性率為8．6％，中晚期陽性率為19．4％，PAGE等［8］在檢測68例早期和30例轉移乳腺癌外周血HER－2表達陽性率分別為11．8％和16．7％，BECHMANN等［14］檢測50例早期乳腺癌患者外周血HER－2的表達陽性率為18．0％，均存在較大的差異。分析原因可能有以下幾點［15］：（1）mRNA的水平：在早期乳腺癌外周血中mRNA水平較低，而中晚期乳腺癌mRNA水平才大量升高；（2）mRNA本身的異質性：不同的乳腺癌相關基因定位了mRNA不同基因位點，使得陽性率產生差異；（3）內源性或外源性因素：比如樣品保存、分離、提取和cDNA的制備等；（4）缺乏質量控制：目前國內外尚無統一的FQ－PCR檢測mRNA的質量控制系統，這也是造成陽性率差異大的主要原因；（5）方法本身的局限性，如假陰性或假陽性。本研究結果發現，BCL－2、CCND1、MUC1、HER－2、hMAM5種基因表達水平在健康對照組和良性乳腺疾病組間差異無統計學意義（P＞0．05），而乳腺癌組均高于其他兩組，差異有統計學意義（P＜0．01）。對五種基因和乳腺癌臨床病理因素關系的分析發現，五種基因mRNA在健康對照組和良性乳腺疾病組及乳腺癌組Ⅰ期的陽性表達率差異無統計學意義（P＞0．05），在乳腺癌組中，腫瘤大小、ER、PR和HER－2比較，差異無統計學意義（P＞0．05），Ⅱ期、Ⅲ＋Ⅳ期組和淋巴結轉移組顯著高于Ⅰ期組和無淋巴結轉移組，差異有統計學意義（P＜0．05），說明級別越高，有淋巴結轉移的乳腺癌的基因表達越強烈。綜合評價5種基因對乳腺癌的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分析結果，HER－2的靈敏度較高，BCL－2的特異性較強。

4結論

由于本研究所選用的基因和研究樣本量的局限，還不能對這5種乳腺癌相關基因在mRNA的表達能否用于乳腺癌的早期診斷和治療的問題做出肯定或否定的回答，但Ⅱ期顯著高于健康對照組和良性乳腺疾病組，說明乳腺癌相關基因檢測對中早期乳腺癌診斷還是有一定意義的。本研究通過對5種基因在健康對照組、良性乳腺疾病組和乳腺癌不同病理學階段陽性率的比較分析，提示當乳腺癌處于中晚期，若能采用嚴格的實驗室質量控制，FQ－PCR檢測mRNA可為臨床提供具有一定的實驗室依據，但對早期乳腺癌的診斷價值，還值得商榷，這與國外的相關報道也是一致的［1，16］。在使用FQ－PCR檢測乳腺癌mRNA時，還應考慮到質量控制、mRNA水平和異質性、腫瘤的不同階段等各個方面的因素，才能有效正確地將乳腺癌相關基因用于乳腺癌的診斷、治療和預后。

作者：余修中1，歐華1，劉懷莉1，鄧君2單位：1．新津縣人民醫院檢驗科，2.．四川省醫學科學院／四川省人民醫院檢驗科