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《齊齊哈爾醫學院學報》2018年第3期

［摘要］puf家族蛋白是一類高度保守的RNA結合蛋白，在真核生物的基因轉錄后調控中起著重要的作用，同時對于低等動物和哺乳動物，PUF同源基因在生殖細胞和配子的發育過程中也起著重要的作用。PUF蛋白具有多種典型的特征和生物功能。目前關于果蠅和線蟲PUF蛋白的研究有很多，但是對哺乳動物PUF蛋白在各個器官組織表達的研究還比較少，PUF蛋白在哺乳動物生長和發育過程中的功能還不明確。

［關鍵詞］RNA結合蛋白;PUF家族;生物功能

真核生物基因表達調控包括轉錄水平和轉錄后水平調控，而轉錄后水平調控分為mRNA穩定性調控和翻譯水平調控［1］。細胞中存在一類與mRNA有高度親和性的蛋白，直接或間接結合到順式調控元件促進mRNA的脫腺苷化和降解，這類蛋白被稱為RNA結合蛋白［2］。PUF(Pumilio和FBF的簡稱)家族蛋白是一類重要的高度保守的RNA結合蛋白，在多種生物中它們不僅結構相關聯，并且能夠結合到3＇UTRs上調節mRNA的翻譯，它們也可以與其他調控蛋白結合起作用，促進mRNA的翻轉或抑制翻譯［3］。PUF蛋白是重要的轉錄后調控因子，但是目前PUF蛋白抑制mRNA翻譯的機制還不明確。PUF蛋白在各個生物體中的表達體現了它們在生物體中具體的功能，但目前哺乳動物PUF蛋白表達的研究還很少。因此，系統性研究哺乳動物PUF蛋白的表達對明確PUF蛋白抑制mRNA翻譯的機制具有重大的意義。

一、PUF蛋白的典型特征

1．多種生物中表達:Pumilio基因最早在果蠅中發現，并且果蠅只有一種Pumilio蛋白。線蟲、釀酒酵母和擬南芥都有多種PUF蛋白，線蟲有9個PUF蛋白，按照結構特點和功能分為四組:FBF組(FBF－1和FBF－2)、PUF－8/－9組(PUF－8和PUF－9)、PUF－5/－6/－7組(PUF－5、PUF－6和PUF－7)、PUF－3/－11組(PUF－3和PUF－11)［4］。哺乳動物—人和小鼠只有兩個PUF蛋白(Pumilio1和Pumilio2)。到目前為止還沒有在真細菌和古生菌中檢測到PUF的存在［3］。PUF家族蛋白廣泛存在，在很多真核生物，包括植物和動物，單細胞和多細胞生物體中都發現該家族成員，因此可以說該蛋白家族進化史悠久。

2．序列和結構高度保守:該家族蛋白從酵母到人類的進化中展現出高度的保守性，研究表明主要是因為在PUF蛋白中存在月牙形的RNA結合功能域(如圖1)，即在兩個相關序列Csp1和Csp2(與Puf重復結構相似的兩個短序列)之間存在8個連續的Puf重復結構，每個重復結構都有一個含有芳香族和基本氨基酸殘基組成的核心共識區，序列長度大約有40個氨基酸［5］。整個Puf重復結構在該蛋白結合RNA時是必須的，同時該區域也與共同調節蛋白存在相互作用，還可以用于挽救PUF蛋白突變造成的缺陷。最近發現果蠅Pumilio的Puf重復結構與人的PUF蛋白的該結構高度相似，均成延伸狀的新月形(如圖2)。每個重復結構折疊成一個三螺旋結構，這些螺旋結構堆積成一個占42半徑圓周三分之一的月牙形。這種月牙形提供兩種延伸的表面:一種結合RNA，一種結合其他的蛋白。RNA結合的位點在新月結構的內側凹面上(含有保守芳香族和基本氨基酸)。Pumilio的內表面長約為90，與預測的含有20～30個核苷酸單體的結合位點長度相一致。作為RNA結合蛋白的Pumilio通常與生殖細胞增殖相關蛋白Nanos和腦腫瘤蛋白Brat共同作用來調節動物的生長發育，結合Nanos和Brat兩個蛋白的位點位于新月結構的外側，特別是7和8重復結構之間的彎曲結構對結合Nanos很重要［6］。

3．調控多種靶標mRNA:個別PUF蛋白調控多種mRNA，例如:果蠅中Pumilio至少結合兩種mRNA—hunchbackmRNA(參與胚胎成形)和cyclinBmRNA(它的抑制延遲了極細胞周期)。線蟲中FBF結合fem－3來影響精子－卵子轉換，若缺失整個FBF蛋白就會擾亂有絲分裂和精子發生過程。同樣地，酵母的puf5調節HOmRNA，從而調節交配類型的轉變［7］。

4．與多種蛋白相互作用:目前已經知道PUF蛋白在生理上和其他三種蛋白相互作用，這三個家族的蛋白也都是由3＇UTR調節因子組成。PUF蛋白與它們相互作用形成特定的復合物，這種復合物可以區別不同的mRNA序列，進而引起不同的生物學變化。與PUF結合的三個家族蛋白如下:(1)Nanos(NOS)蛋白:Nanos蛋白具有兩個不同的CCHC鋅指結構，它能夠在不存在PUF蛋白的情況下非特異性結合RNA。FBF可以結合NOS－3(3個線蟲NOS蛋白之一)，果蠅的Pumilio可以與單個NOS相互作用。線蟲的兩個NOS蛋白NOS－1和NOS－2，選擇性地和不同的PUF蛋白結合形成不同的PUF－NOS蛋白復合物。同樣地，在非洲爪蟾蜍的卵母細胞中PUF蛋白結合XCAT－2(NOS同源)［8］。(2)細胞質聚腺苷酸化元件結合蛋白(CPEB):CPEB蛋白在CCCC和CCHC鋅指結構(結合RNA所必須的)后有兩個RRM區域，所有多細胞動物中都有它的同源染色體基因，它們結合到mRNA的3＇UTR中U很豐富的序列上，來調控mRNA的聚腺苷酸化和翻譯。線蟲的FBF與CPEB的同源基因CPB－1相互作用，兩者中任何一個活性降低，都會導致精子發生過程受阻。蟾蜍的PUF蛋白在卵巢中結合CPEB，但這個復合物的功能目前還不清楚［9］。(3)Brat蛋白:果蠅的Brat蛋白是NHL家族成員之一，它有六個含有44個氨基酸殘基的序列組成，每個序列都含有甘氨酸、疏水性殘基和帶電氨基酸集群［3］。Brat可以與Pumilio、Nanos和mRNA形成四元復合物，突變Brat蛋白中的單個氨基酸都不利于四元復合物的形成。線蟲的兩個典型的基因(ncl－1和lin－41)也含有NHL結構域，ncl－1調控核仁的大小和rRNA的數量;lin－41抑制分化和促進特異體細胞的有絲分裂，這與PUF在干細胞中的功能相似［8］。

二、PUF蛋白的生物功能

1．功能多樣性:分析五種PUF蛋白(線蟲FBF、網柄菌PufA、果蠅Pumilio、啤酒酵母的PUF3和PUF5)的生物功能，發現PUF蛋白的生物功能呈現顯著多樣性，例如:果蠅Pumilio通過抑制hunchback(弓背蛋白)的mRNA來調控早期胚胎出生前后的形態;線蟲的FBF通過抑制fem－3來調控從精子發生到卵子發生的轉變;酵母的PUF蛋白調控衰老、線粒體功能和交配類型的轉換;網柄菌PufA促進植株的生長［10］。在一種物種中，單一的PUF蛋白可能調控多種mRNA，具有多種功能。例如:線蟲的FBF不僅在精子和卵子的轉換中起到重要的作用，而且還參與生殖干細胞的維持，在胚胎形成過程中與其他四種PUF蛋白一起調控生殖細胞系的存活、遷移和抑制生殖細胞的有絲分裂。因為果蠅的Pumilio在胚胎形成中生殖細胞的遷移和抑制有絲分裂方面也發揮作用，所以說這種生殖功能可能是遺傳的［11］。

2．共同功能—維持干細胞:盡管PUF蛋白功能具有多樣性，但是每個物種的PUF蛋白都有一個共同的作用———維持干細胞。如果沒有Pumilio，雌果蠅生殖干細胞過早分化成包囊細胞;如果沒有FBF，線蟲生殖干細胞就進入減數分裂和完成精子發生過程。另外，盤基網柄菌的PufA和酵母的PUF5在正常情況下也可以維持干細胞的有絲分裂增殖。因此，在這幾種遙遠的多細胞動物中，PUF蛋白都促進生殖干細胞的增殖和抑制它們分化［5－7］。

三、生物體PUF蛋白表達及功能的研究進展

目前，有很多研究者研究了哺乳動物PUM蛋白的功能，例如:陳霞等［12］研究PUF家族基因(Pum1和Pum2)在雌性生殖能力和生殖細胞減數分裂過程中的作用，結果表明Pum蛋白不影響小鼠卵子發生生育過程;楊定等［13］建立了Pumilio1和Pumilio2雙基因條件性敲除小鼠模型，為其后期進一步研究PUF家族在哺乳動物精子發生中生物學功能奠定基礎;Chen等［14］研究表明在哺乳動物中，Pumilio1通過抑制p53的多個激活因子來保護精子發生的過程;DanislavS等［25］通過對人的RNA結合蛋白PUF家族—Pum1和Pum2基因的克隆和系列的對比分析，結果發現PUM1和PUM2蛋白的相似度達到83%，二者的RNA結合功能域相似度高達91%;JenniferA等［16］研究了人類的Pumilio蛋白可以通過直接或者間接的方式功能性調控一些靶標RNA的識別，同時又證實了Pumilio蛋白可以調控非編碼RNA［17］;Liu等［18］研究報道PUM1是一種先天免疫基因的抑制因子，可以抑制LGP2基因(抗病毒先天免疫途徑RLR家族成員之一)的表達。PUF家族在疾病方面的研究也有報道，CécileNaudin等［19］通過多種分子生物學實驗研究發現PUMILIO/FOXP1信號通路會驅動造血干細胞/白血病細胞的擴增。Wu等［20］研究顳葉癲癇患者和鋰－匹羅卡品癲癇大鼠模型中PUM蛋白的表達情況，發現Pumilio2蛋白的表達降低，說明Pumilio2蛋白表達與癲癇有關系。關于PUF家族基因在不同生物體中的表達，目前研究者們主要用NorthernBlot和RT－PCR實驗從mRNA的角度來分析了該家族基因在酵母、果蠅、線蟲、斑馬魚［21-22］、蟾蜍和側褶蛙［23-24］、小鼠和人［25］的某一組織或某些組織中的表達水平，發現PUF家族蛋白在生殖發育和干細胞維持方面都起著重要的作用。但是目前在哺乳動物中關于PUF蛋白表達的研究還不多，從mRNA和蛋白水平系統性研究哺乳動物PUF蛋白的表達還未見報道。因此，系統性研究哺乳動物PUF蛋白的表達對明確PUF蛋白抑制mRNA翻譯的機制具有重大的意義。

作者：王坤；任麗英；馬允