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《眼科新進展雜志》2016年第一期

【摘要】

目的研究纖維蛋白黏合膠黏合淚道對雄兔去勢所致干眼癥的緩解作用。方法選擇新西蘭白兔36只(36眼，均為右眼)，剪除第三眼瞼后，3g•L－1氧氟沙星滴眼液滴眼1周，隨后繼續適應性喂養1周，取24只雄兔制作去勢雄兔干眼癥模型，隨機分為A、B兩組(各12眼):對照組(A組)淚道注射生理鹽水，實驗組(B組)淚道內注射纖維蛋白黏合膠。剩余12只(12眼，C組)雄兔切開陰囊，不切除睪丸，眼部不予處理，作為假手術組。分別于注射前和注射后2周、4周及8周行SchirmerⅠ試驗(SchirmerⅠtest，SⅠT)、角膜熒光素(fluesce-in，FL)染色、淚液蛋白測定，并于注射后2周、4周對B組淚道黏膜進行K16免疫熒光染色及WesternBlot檢查。結果C組注射前及注射后各時間段各項檢測差異均無統計學意義(均為P＞0．05)。注射后2周、4周及8周，A、B兩組SⅠT、FL染色評分、淚液總蛋白含量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性較注射前均有不同程度下降，其差異均有統計學意義(均為P＜0．05)，但注射后2周及4周B組SⅠT、FL染色評分下降程度較輕，與A組下降程度相比差異均有統計學意義(均為P＜0．05)。而B組淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性則在注射后4周出現下降減緩，與A組相比差異均有統計學意義(均為P＜0．05)。免疫熒光染色和WesternBlot結果顯示B組下瞼淚道黏膜K16陰性表達。結論使用纖維蛋白黏合膠黏合淚道可較快而明顯地改善干眼的癥狀和維持淚液蛋白成分，從而延緩去勢雄兔干眼癥的進展。

【關鍵詞】

纖維蛋白黏合膠;干眼癥;淚液蛋白

干眼癥是由于淚液的量、質或流體動力學異常引起的淚膜不穩定和眼表面損害，導致眼部不適及視功能障礙。干眼癥患病率逐年上升，嚴重影響著患者視力和生活。流行病學研究顯示，干眼癥在我國的發病率與亞洲其他國家類似，較美國及歐洲國家高，其發生率為21%～30%［1］。目前國內治療干眼癥方法有:人工淚液滴眼，對輕度干眼癥可以取得較好效果，但對中重度干眼癥效果不好，且頻繁滴眼導致人工淚液中防腐劑損傷眼表結膜囊杯狀細胞加重干眼;淚小點封閉是治療重度干眼癥的有效方法之一，但使用激光封閉不僅帶來疼痛不適，而且留下瘢痕手術不可逆。淚小管/點栓塞是目前較好的淚道封閉技術，使用物理阻塞的方式減少淚液流失可以改善眼表微環境，緩解干眼癥狀，手術可逆，但淚道栓子價格較貴、給患者帶來一定的經濟負擔，也可能繼發淚小管炎等并發癥。纖維蛋白黏合膠是以血纖維蛋白為原料制備的，模擬凝血過程而起到止血作用，同時具有黏合作用，有愈合好、吸收好的優點，現已應用于眼科臨床;而目前將其用于封閉淚道方向的實驗研究國內外尚未見相關報道。本研究將纖維蛋白黏合劑用于黏合淚道，并與生理鹽水進行對比研究，探討纖維蛋白黏合膠在治療干眼癥損傷中的應用效果，為以后提高干眼癥的臨床治愈率提供一定的實驗依據。

1材料與方法

1．1實驗材料纖維蛋白黏合劑(上海萊士血制品有限公司)，SchirmerⅠ試紙(博士倫公司)，聚氯乙烯塑料薄膜、濾紙(上海半島實業有限公司)，K16抗體(美國Sigma公司)。

1．2動物分組及手術成年健康新西蘭白兔36只，1．5個月齡，均為雄性，體質量1．5～2．0kg(實驗動物由南昌大學醫學院動物實驗部提供)。使用裂隙燈顯微鏡和眼底鏡檢查眼前節及眼底無異常，同時Schirm-erⅠ試驗(SchirmerⅠtest，SⅠT)≥10mm/5min。將健康新西蘭白兔36只剪除第三眼瞼，3g•L－1氧氟沙星眼液滴眼1周后繼續適應性喂養1周。參照馬軼群等［2］的方法，將24只雄兔行雙側睪丸切除術(chiec-tomized，ORX)后隨機分為2組(每組12只，均為右眼):A組淚道內注射生理鹽水、B組淚道內注射纖維蛋白黏合膠。余12只(12眼，C組)雄兔切開陰囊，不切除睪丸，眼部不予處理為假手術組。

1．3手術方法A組和B組分別于兔淚小管段注入生理鹽水及纖維蛋白黏合膠，具體注入方法參考文獻［3］:B組使用4g•L－1鹽酸奧布卡因(倍諾喜)滴眼液滴眼1次進行表面麻醉，一手持棉簽輕輕壓迫下眼瞼內側，暴露下淚點，另一手持雙聯注射器將頭端連接的淚道沖洗針自下瞼結膜淚點進針，順淚管前進約2mm，注射纖維蛋白黏合膠0．2mL(凍干人纖維蛋白原和凍干人凝血酶各0．1mL)，邊注射邊拔針。以棉簽拭去溢出的膠體，用無菌玻璃棒輕壓淚小點局部約30s。裂隙燈觀察淚點外無溢出凝結的膠體后局部滴3g•L－1氧氟沙星滴眼液。A組同法淚道內注入生理鹽水0．2mL。C組白兔眼部不作處理。3組白兔于注射前、注射后2周、4周及8周行SⅠT檢查、角膜熒光素(fluescein，FL)染色及淚液蛋白測定。同時注射前、注射后2周及4周處死B組實驗兔各2只，解剖分離兔術眼淚道黏膜組織，并對其進行角蛋白16(keratin16，K16)的免疫熒光染色和WesternBlot檢測。

1．4SⅠT檢測及FL染色SⅠT檢查方法:取有刻度的試紙5mm×35mm，一端反折5mm，放入被測眼下結膜囊的中外1/3處，靜待5min后取出濾紙，測量濕長。參照文獻［1］的標準，以≥10mm/5min為正常。每次檢查應注意控制變量，應由同一操作者在相同時間、地點、照明亮度、濕度及溫度下操作FL染色檢查方法:將1滴10g•L－1熒光素鈉滴眼，囑其瞬目，評分系統參考文獻［4］分為0～3級:無染色(0級);很少的播散性污漬染色(1級);中度污漬染色(2級);重度融合性污漬染色(3級)。

1．5淚液蛋白測定于上午9點到11點收集淚液樣品，毛細吸管吸取兔下淚河約20μL非刺激性淚液，置于－80℃冰箱中0．5mLEP管(Eppendf，Fremont，CA)保存。以小牛血清白蛋白為標準，Brandfd法測定淚液總蛋白含量。使用4，6-亞乙基-對硝基苯-α-D-麥芽七糖苷(EPS-PNP-G7)測量淀粉酶活性(LeadmanGroupCo．，Ltd．，北京)［5］。雙色讀數在405nm和546nm采用自動生化分析儀分析(LX20;Beckman，Fullerton，CA);采用放射免疫分析法測定乳鐵蛋白［6］:取淚液樣品10μL，用生理鹽水1∶100稀釋，制作標準曲線后計算出乳鐵蛋白含量。采用試管比濁法測定溶菌酶含量，溶菌酶測試盒、制備染色菌液、配制溶菌酶標準液及繪制標準曲線均按說明書進行;將淚液與染色菌液混勻，離心后取上清液，根據測定管與樣品對照管光密度差值，查標準曲線得出樣品中溶菌酶含量。

1．6免疫熒光染色(1)將B組注射前、注射后2周及4周白兔淚道黏膜組織冰凍切片取出復溫，常溫下晾干;(2)PBS洗凈:10min×3次;(3)羊血清封閉:37℃45min;(4)孵育一抗(K16，羊抗兔)，4℃過夜，一般要大于18h;(5)4℃PBS洗凈，10min×3次;(6)二抗(FITC標記IgG，羊抗兔)避光37℃1h;(7)37℃PBS洗凈，10min×3次晾干;(8)OLYMPUS共聚焦顯微鏡拍照。

1．7WesternBlot檢查選擇80g•L－1SDS-PAGE膠電泳分離煮過的淚道黏膜蛋白質組織樣品(B組注射前、注射后2周及4周白兔淚道黏膜組織)，55mA電泳大約2h直至溴酚藍到達凝膠底部，PVDF膜甲醇溶液浸潤，穩流電轉30min～1h。電轉后去除電泳膠，將PVDF膜放于明膠(濃度為2．5g•L－1)封閉液中，室溫緩慢進行30min搖晃或在4℃封閉液內封閉過夜，加入一抗溶液(K16，濃度為1∶150)，室溫孵育1～2h或4℃孵育過夜，用TBST沖洗3次，與一抗(K16，濃度為1∶150)相對應的帶辣根過氧化物酶的二抗溶液(濃度為1∶150)，室溫孵育1～2h或4℃孵育并進行過夜，TBST3次漂洗，增強型化學發光劑浸潤自顯影。

1．8統計學方法采用GraphPadPrism4．0統計軟件處理實驗數據，計量資料以x珋±s表示，計數資料用χ2檢驗;各組注射前后及兩組間同一時間點的均數比較采用student-t檢驗及Dunnetttest檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2．1治療前后及兩組間各項干眼檢測指標評定結果比較C組注射前、注射后2周、4周及8周SⅠT和FL染色評分相比差異均無統計學意義(均為P＞0.05)。A、B兩組淚道處理前，SⅠT和FL染色評分相比差異均無統計學意義(tSⅠT=0．712，tFL=0．352，均為P＞0．05);治療2周、4周及8周后，B組SⅠT和FL染色評分較治療前稍有改變，差異均有統計學意義(tBSⅠT=0．874、0．716、0．538，tBFL=5．162、7．378、8．743，均為P＜0．05)，而A組SⅠT和FL染色評分較處理前明顯惡化，差異均有統計學意義(tASⅠT=6.125、7．117、10．267，tAFL=4．642、6．157、8．196，均為P＜0．05)。A、B兩組在注射后2周、4周時SⅠT和FL染色評分相比，差異均有統計學意義(tSⅠT=3.231、5．163，tFL=4．581、9．174，均為P＜0．05)，但A、B兩組在注射后8周時SⅠT和FL染色評分相比，差異均無統計學意義(tSⅠT=1．102，tFL=0．984，均為P＞0．05，見表1)。

2．2兩組用藥前后各時間點淚液蛋白比較C組注射前、注射后2周、4周及8周淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性相比差異均無統計學意義(均為P＞0．05)。處理前A、B兩組淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性相比較，差異均無統計學意義(t=0．953、0．824、0．613、0．520，均為P＞0．05);注射后4周，B組淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性與注射前相比差異均有統計學意義(均為P＜0．05)，注射后2周和8周，淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性與A組相比差異均無統計學意義(均為P＞0．05)，而A組在各個時間點淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性與處理前相比均有不同程度下降，差異均有統計學意義(t=7．501、8．152、8．982、9．420，均為P＜0．05);A、B兩組注射后4周淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性相比，差異均有統計學意義(均為P＜0．05，見表2)。

2．3纖維蛋白黏合劑黏合淚道在兔干眼癥中應用效果B組纖維蛋白黏合劑黏合淚道前，淚道黏膜K16呈陰性表達(圖1A)，纖維蛋白黏合劑黏合淚道2周后，兔下瞼淚道管口黏合，不通暢，而取其下瞼淚道黏膜進行K16染色呈陰性表達(圖1B)，纖維蛋白黏合劑黏合淚道4周后，兔下瞼淚道管口敞開，淚道通暢，而取其下瞼淚道黏膜進行K16染色，發現K16在淚道黏膜上皮幾乎無表達(圖1C)。WesternBlot結果顯示去勢雄兔纖維蛋白黏合劑黏合淚道處理前、處理后2周、4周兔淚道黏膜K16表達情況見圖1D。

3討論

由于干眼癥發病機制仍不清楚，臨床將干眼癥分為水樣液缺乏型干眼癥和蒸發過強型干眼癥，目前基于病理生理機制建立干眼模型已被用于實驗研究。新西蘭兔共有三對淚腺即主淚腺、第三眼瞼上腺和第三眼瞼下腺。主淚腺以漿液性為主的混合性腺，第三眼瞼上腺為漿液性腺，第三眼瞼下腺是皮脂腺，分泌淚膜脂質層以保護眼球表面及結膜囊［7］，手術摘除第三眼瞼可以降低水液層及脂質層分泌，但模型形成時間較長，為縮短模型準備時間可同時建造去勢動物模型。眼部是性激素作用的靶器官之一，雄激素、雌激素、孕激素和催乳素受體廣泛存在于人、兔和鼠的淚腺、瞼板腺及角膜等眼表組織［8］，性激素隨年齡變化而降低是干眼癥發病的主要原因之一，對雄兔行雙側睪丸切除后，可出現淚腺上皮細胞萎縮，腺泡泡狀黏液消失及結膜杯狀細胞減少。

兩種方式相結合誘導動物模型在淚液分泌的質量改變及淚膜穩定性降低更為嚴重，縮短了建模時間。劉祖國等［9］認為眼表(角膜、結膜、副淚腺和瞼板腺)、主淚腺和它們之間的神經連接組成的淚腺功能單位共同發揮對淚腺分泌和淚膜形成的調控作用，維護眼表的健康，其中任何環節的損害均可導致淚膜完整性和正常功能的破壞，如這些因素不能消失，則引起眼表的病理改變。使用淚道栓塞治療干眼機制較為明確:增加淚液儲留，改善眼表微結構，避免了免疫蛋白和離子成分流失，提高了眼表防御能力，也保護了淚腺、結膜杯狀細胞，促進淚液和黏蛋白分泌，增加淚膜穩定性，同時可以減少人工淚液和其他治療性藥物的流失，減少用藥頻率。國內臨床上使用淚道栓子多為進口產品、價格高，且有可能引起繼發淚小管炎等并發癥。纖維蛋白黏合膠具有黏合迅速、刺激小、反應輕的特點，凝結成的纖維蛋白膠體可被組織釋放的纖維蛋白溶解酶逐漸降解并且價格低廉，是作為淚道封閉的理想材料。

本實驗表明，B組在用藥2個月后可明顯改善去勢雄兔SⅠT，表明淚道封閉后眼表淚液量增加使眼表刺激癥狀緩解，并且修復淚膜功能;而A組SⅠT明顯惡化，可能與干眼癥的進行性加重有關;其次，B組淚液蛋白含量與處理前相比未見明顯改變，而A組淚液蛋白含量明顯下降，李軍等［10］認為干眼癥患者淚腺的分泌功能不足是造成淚液蛋白濃度降低的原因，其研究還顯示淚液中乳鐵蛋白與BUT呈正相關，可能原因是纖維蛋白黏合膠封閉淚道使淚液分泌水平上升，延緩了干眼癥的發生，維持了淚液蛋白的穩定，而A組干眼癥惡化使淚液蛋白分泌減少或成分丟失變異;再次，B組FL染色評分改善而A組明顯惡化，Benelli［11］發現使用人工淚液能減少CSF評分和結膜充血，延長淚膜破裂時間，促進角膜上皮細胞再生潤滑眼表，減少摩擦和淚液蒸發，有助于眼表組織修復。本實驗通過纖維蛋白黏合膠行淚道封閉使SⅠT增高，比人工淚液更有利于角膜損傷的修復，改善眼表環境，維持角膜表面光滑，為正常視力提供了基本保障。

細胞角蛋白是角質細胞的主要骨架蛋白，主要表達于上皮細胞，目前已經證實的細胞角蛋白有20多種，隨細胞類型和分化程度不同而表達類型有差異，其中K16表達在過度增生的上皮及有關疾病組織中，如皮膚病、口腔黏膜病等，劉祖國等［12］研究通過對比正常結膜及翼狀胬肉組織中K16的表達情況，發現正常結膜上皮K16染色極弱或陰性，而胬肉組織中K16全層表達，提示結膜上皮細胞增生活躍及過度角化是引起翼狀胬肉的另一重要分子機制。本實驗檢測兔淚道黏膜組織中K16的表達情況，發現纖維蛋白黏合膠組黏合淚道后2周和4周K16在淚道黏膜上皮均呈陰性表達，這提示淚道黏合過程中不伴隨淚道黏膜上皮的異常增殖及過度分化，由此我們推測黏合淚道這可能僅僅是一個物理過程，并不影響K16的表達。綜上所述，對于去勢雄兔干眼癥，纖維蛋白黏合膠黏合淚道可較快而明顯地改善干眼的癥狀和維持淚液蛋白成分。它是一種安全有效、給藥途徑簡單、副反應少且廉價的治療干眼的方法，具有廣泛臨床應用及推廣價值。

參考文獻

［1］中華醫學會眼科學分會角膜病學組．干眼臨床診療專家共識［J］．中華眼科雜志，2013，49(1):73-75．

［2］馬軼群，王傳富，劉美光．雄兔干眼病模型角膜上皮細胞凋亡相關基因表達的研究［J］．眼科研究，2004，22(3):286-289．

［3］邸新，趙宇丹，劉玉哲，姚濤．蛋白膠封閉淚道治療干眼癥的臨床觀察［J］．沈陽醫學院學報，2009，11(2):87-90．

［4］LEMPMA．ReptoftheNationalEyeInstitute/IndustryWkshoponClinicalTrialsinDryEyes［J］．CLAOJ，1995，21(4):221-232．

［5］CHENZY，JIEY，YUGY．Treatmentofseverekeratoconjunctivi-tissiccabyparotidducttranspositionaftertympanicneurectomyinrabbits［J］．InvestOphthalmolVisSci，2011，52(9):6964-6970．

［6］邵毅，余瑤，王樂，張廣斌，付新元，裴重剛，等．真性糖尿病白內障患者超聲乳化術后角膜神經和淚液蛋白的特點［J］．中國糖尿病雜志，2014，22(3):216-219．

［7］劉莎，白文霞，吉蘭姣，蘇寧，喬紅群．SD大鼠、Beagle犬和新西蘭白兔主淚腺的解剖學特點及形態學觀察［J］．四川動物，2012，30(6):956-960．

［8］劉超，王傳富．Nfk-Bp65-NOS2在去勢雄兔角膜、結膜和淚腺中的表達及意義［J］．眼科研究，2006，24(1):81．

［9］劉祖國，楊文照．干眼癥的發病機制［J］．眼科，2005，14(5):342-345．

［10］李軍，劉亞丹，陳紅娟，李丹，陳光．淚液乳鐵蛋白及表皮生長因子與干眼癥相關性研究［J］．第四軍醫大學學報，2009，30(16):1471．

［11］BENELLIU．Systanelubricanteyedropsinthemanagementofoculardryness［J］．ClinOphthalmol，2011，5(4):783-790．

［12］劉祖國，張梅．翼狀胬肉上皮細胞異常表達角蛋白［J］．眼科研究，2000，18(5):392-394

作者：杜娟 姜楠 邵毅 胡佩宏 張穎 魏榮 劉新華 裴重剛 單位：佛山市順德區第一人民醫院 南方醫科大學附屬順德第一人民醫院眼科