本站小編為你精心準備了中藥三萜皂苷的生物信息學分析參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《中成藥雜志》2015年第六期

1方法

1.1蛋白質理化性質分析蛋白質全長序列的理化性質應用在線軟件ExPASy分析。其中，利用ProtParam模塊根據具體的氨基酸序列，進行氨基酸數目、相對分子質量、理論等電點和不穩定指數的測算，然后利用ProtScale模塊進行親水性/疏水性分析。

1.2結構域分析在NCBI的ConservedDomainDatabase和SMART數據庫中進行蛋白質的保守域和功能域預測，并通過WebLogo［9］對其做進一步分析。利用基于同源建模的分析工具SWISS-MODEL預測蛋白質的三維結構。

1.3構建系統進化樹利用MEGA5.0軟件［11］中的ClustalW進行序列比對，然后利用Neighbor-Joining(NJ)法構建系統進化樹(bootstrap1000)。

2結果與分析

2.1鯊烯合成酶鯊烯合成酶(squalenesyn-thase，EC2.5.1.21)是一種定位于內質網上的膜結合蛋白［12］。在類異戊二烯代謝途徑中，它以法尼二磷酸為底物，催化合成30C產物角鯊烯。由于處于甾醇與三萜合成通路的分支點，決定著法尼基焦磷酸的流向，因此鯊烯合成酶發揮著重要的調節作用。已有研究表明，鯊烯合成酶的結構和反應機制在動植物中相當保守。在哺乳動物中，該成分大約包含416aa，相對分子質量約為47kDa;在模式植物擬南芥中，該成分有2個(NP_195190.1和NP_195191.2)，其外顯子具有高度同源性［13］。本研究從NCBI數據庫中共下載得到17種中藥的24條蛋白質全長序列，長度在405～418aa之間，相對分子質量在45.89～47.89kDa之間，理論等電點在6.07～8.53之間，多數為不穩定蛋白質(不穩定指數＞40)。以人參中的三條鯊烯合成酶序列(BAD08242.1，ACV88718.1和ACZ71037.1)為例，利用ProtScale模塊進行疏水性/親水性分析，由于其序列高度保守，所展現出的親水性/疏水性規律較為一致，見圖1。另外由圖可知，鯊烯合成酶的N端分布有親水域(分值＜－0.5)，而C端則分布有一段較短的強疏水域(分值＞0.5)，這與之前有關鯊烯合成酶細胞定位的報道相一致。鯊烯合成酶通過短的C端跨膜區錨定于內質網上，而N端的催化域則伸向胞質溶膠中。在對其序列進行理化性質分析的基礎上，進一步研究其保守域。首先采用WebLogo對Lee［15］等報道的6個保守域進行分析，結果發現在17種中藥中，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ三個保守域高度保守，而Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ三個保守域保守性較差，見圖2A。由此可見，之前對這6個保守域的報道具有一定局限性。根據NCBI的ConservedDomainDatabase的預測結果比對發現，這17種中藥中的鯊烯合成酶具有兩個高度保守(100%)的區域———富含天冬氨酸的鎂離子結合位點1和2，見圖2B(結合位點1位于77～81aa，結合位點2位于213～217aa)，該區域與15C法尼基和20C香葉基異戊二烯基二磷酸的1'－1'位縮合反應相關，其保守性保證了鯊烯合成酶與底物特異性結合，并可作為今后鑒定中藥中該成分的重要依據。以人參中的三條鯊烯合成酶序列(BAD08242.1，ACV88718.1和ACZ71037.1)為例，SWISS-MODEL建模的結果顯示，人參中鯊烯合成酶的三維結構相對保守，以α螺旋為主，而β折疊片較少，無規則卷曲等結構均很保守。以模式物種擬南芥等植物中的鯊烯合成酶蛋白質全長構建進化樹，見圖3。由圖可知，進化樹首先分為兩大支，其中上面一支主要包含較高等的植物類群，主要為雙子葉植物;下面一支以紫杉Taxuschinensis(Pilger)Rehd．、馬尾松Pinusmasso-niana為代表，多為較低等的植物類群。整體而言，鯊烯合成酶具有較高的保守性和較為普遍的基因倍增現象，例如人參、丹參、北柴胡等6種中藥具有兩個及兩個以上鯊烯合成酶。由于其具有較為重要的生理生化功能，故認為適應性進化可能導致了普遍的基因倍增，從而產生了不同的亞型，之間可能存在的功能上的互補和增強，又是酶功能進化的一種體現。

2.2鯊烯環氧酶鯊烯環氧酶(squaleneepoxi-dase，EC1.14.13.132)是一種細胞膜結合蛋白，催化三萜合成的第一步氧化反應，是該合成通路的限速酶之一。以三七和人參中的鯊烯環氧酶序列為例，利用ProtScale模塊進行疏水性/親水性分析，可以看出，三七和人參中的兩條鯊烯環氧酶蛋白質全長序列出現了較為明顯的分化;三七中的ABE73759.1與人參的BAA24448.1具有較為一致的親水性/疏水性規律;三七中的AFV92748.1與人參的ACJ24907.2具有較為一致的親水性/疏水性規律;這說明這兩種亞型之間的分化早于三七和人參之間的分化，并在隨后的進化中形成了自己獨特的親水性/疏水性規律。對其進行功能域分析，見圖5A。由圖可知，鯊烯環氧酶的C端含有一個高度保守的跨膜結構域(5～27aa)，然后是1個重疊的FAD結合域(NADPH結合域，60～408aa)和鯊烯環氧酶結構域(pfam08491，211～484aa)。藥用植物中的鯊烯環氧酶蛋白質序列呈現出較高的同源性，以模式植物擬南芥和中藥代表物種人參為例，通過SWISS-MODEL進行三維結構的預測，見圖5B。由圖可知，鯊烯環氧酶的α螺旋和β折疊片等結構保守，無規則卷曲部分為可變區，其中連接β折疊片者較為高變。以模式物種擬南芥等植物中的鯊烯環氧酶蛋白質全長構建進化樹，見圖6。由圖可知，進化地位較為低等的蕨類植物———蛇足石杉作為外群，位于進化樹的底部;五加科的人參、三七、刺五加等植物聚為一支，顯示出較近的親緣關系。該進化樹較好地符合物種之間的進化規律，說明鯊烯環氧酶伴隨物種的進化進程趨于保守，只在特定類群中出現了基因倍增的現象，如五加科，這可能與該科物種特定的生境與生理習性相關，例如，某種環境壓力迫使其特定通路的完善或者特定代謝產物的富集。

2.32，3-氧化鯊烯環化酶氧化鯊烯環化酶(ox-idosqualenecyclases，EC5.4.99.7)是一大類氧化鯊烯環化酶的統稱，能催化一系列復雜的環化和重排反應。在植物中，由于它可催化三萜皂苷合成中的第一步環化反應，因而被認為是合成通路中的關鍵酶。本研究對其中的2，3-氧化鯊烯環化酶進行深入的分析，發現它在真菌、動物和植物中均較為保守。從NCBI中共下載得到4條中藥的2，3-氧化鯊烯環化酶全長蛋白序列，包括人參、百脈根、蒲公英、總狀升麻，長度在757～780aa之間，相對分子質量在86.18～88.83kDa之間，理論等電點在5.89～8.07之間，全部為不穩定蛋白質(不穩定指數＞40)，見表3。利用ProtScale模塊對其進行疏水性/親水性分析，可見4條中藥的2，3-氧化鯊烯環化酶序列具有較為一致的親水性/疏水性整體規律，但親水區域和疏水區域的強弱程度略有不同，見圖7。通過SWISS-MODEL進行三維結構的預測，見圖8。由圖可知，2，3-氧化鯊烯環化酶結構穩定，與模式植物擬南芥相比，無規則卷曲部分存在一定程度變化，而且其多分布于蛋白質表層。但由于序列有限，構建的系統進化樹并不能很好地反應該酶的系統進化規律，見圖9。

3討論

中藥中所含的三萜皂苷成分類型眾多，而且結構復雜。通過對其合成通路中關鍵酶的系統分析發現，鯊烯合成酶、鯊烯環氧酶、2，3-氧化鯊烯環化酶均較為保守，說明雖然三萜皂苷的合成是一個高度復雜的動態過程，但其苷元碳環骨架構成等上游步驟在進化中趨于保守和穩定，而且該成分眾多類型的形成可能與下游細胞色素P450、糖基轉移酶、β-糖苷酶等的修飾有關。另外，不同類型細胞色素P450催化的羥化反應和糖基轉移酶催化的糖基反應可能是物種特異性三萜皂苷形成的原因。但由于細胞色素P450和糖基轉移酶均為超家族［17-19］，序列的同源性低，專一性高，大多尚未驗證在三萜皂苷通路中的酶活性，難以進行系統進化分析，是目前通路水平三萜皂苷研究的難點［20］。除了應用傳統的基因克隆方法外，還可以采用高通量測序的手段，對三萜皂苷合成通路及關鍵酶進行全面闡釋。例如在人參的轉錄組分析中，共發現了133個細胞色素P450和235個糖基轉移酶，其中有6個UDP-糖基轉移酶可能直接參與人參皂苷的合成［20］;在西洋參的轉錄組中發現了150個細胞色素P450和235個糖基轉移酶，其中有1個細胞色素P450和4個UDP-糖基轉移酶可能直接參與皂苷的合成［21］。雖然很多三萜苷元碳環骨架上復雜的修飾反應尚不清楚，但是通過對通路上游關鍵酶的分析，已經具備了人工合成三萜苷元碳環骨架的理論基礎，增加了對三萜皂苷合成通路進化規律的認識。鯊烯合成酶所具有的2個高度保守區域可作為今后認定該類酶的重要依據，并發掘更多的三萜皂苷藥用資源。下一步研究的重點將是考察通路中不同基因的表達模式［23］，并且結合轉錄組和代謝組，高通量地篩選藥用植物中的細胞色素P450和UDP-糖基轉移酶，系統地比較不同修飾體的活性差異，探究其修飾規律，推進人工合成三萜皂苷的進程。

作者：張召寶 侯林 崔清華 潘晴 馬魯豫 單位：山東中醫藥大學藥學院 山東省醫學科學院