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《中國動物傳染病學報》2015年第三期

1材料和方法

1.1試劑和儀器甲醛、乙醇、冰醋酸混合（FAA）固定液的配制：48%無水乙醇、10%甲醛、2%冰醋酸、40%去離子水；鹽酸卡紅染液的配制：取4g卡紅粉溶于鹽酸蒸餾水中邊加熱邊攪拌至沸騰，再加入85%乙醇95mL，冷卻后過濾加氨水調pH至7.0備用；透射電鏡的樣本固定液為PBS配制的2.5%戊二醛溶液；DAPI（貨號：40011）為美國Biotium公司產品；鹽酸卡紅（國藥71009382）；凋亡檢測試劑盒（promega，G3250，美國）；4%多聚甲醛（鼎國，ARO211）；激光共聚焦顯微鏡（NikonC1Si）；透射電子顯微鏡（FEIT12）；普通光學解剖鏡（OlympusSZX10）。

1.2實驗動物和釘螺BALB/c（6周齡）小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司；日本血吸蟲中國大陸株尾蚴由中國農業科學院上海獸醫研究所血吸蟲研究室提供。以腹部貼片法感染日本血吸蟲尾蚴，為保證有單性感染雌蟲，每1只小鼠僅感染來于1個釘螺釋放的尾蚴。分別于感染后25d剖殺，以肝門靜脈灌注法收集蟲體，獲得蟲體后隨機挑選出雌蟲，立即進行普通光學顯微鏡下拍照。充分洗滌后分別于FAA固定液、2.5%戊二醛、4%多聚甲醛中固定，以用于各項試驗；對于合抱蟲體待其在冰水混合PBS中自行分離后挑出雌蟲固定備用。

1.3激光共聚焦標本制備及觀察參考文獻[6]，將蟲體放入FAA固定液中過夜充分固定后，取出蟲體后在鹽酸卡紅染液中染色12h左右，然后用0.5%鹽酸乙醇脫色，蟲體分別經70%、80%、90%、100%梯度乙醇脫水。脫水后蟲體依次經過等體積無水乙醇及二甲苯混合液、純二甲苯透明。蟲體移至載玻片，滴適量中性樹膠，蓋上蓋玻片封固，平放晾干。用激光共聚焦顯微鏡觀察，發射波長為488nm，掃描激發值為78%，圖像保存為512×512像素類型。

1.4透射電子顯微鏡觀察卵黃腺將固定于2.5%戊二醛溶液的蟲體取出，采用常規超薄切片制作方法制作切片，切片厚度約為70nm。具體操作：樣本清洗→鋨酸固定→梯度脫水→丙酮置換→浸漬→包埋→聚合→修塊和超薄切片→鈾染→鉛染，處理后在透射電子顯微鏡下觀察。在切片過程中，橫切位置為單一蟲體的后2/3位置，此處為混合和單性感染雌蟲卵黃腺所在位置。

1.5TUNEL法觀察卵黃腺凋亡現象將4%多聚甲醛溶液固定蟲體用于石蠟包埋并切片，切片厚度5μm。按照DeadEndTMFluorometricTUNEL（Promega，G3250，美國）試劑盒的操作步驟進行脫蠟、洗滌、通透、熒光染色標記，終止反應后洗滌，用10μg/mLDAPI室溫孵育10min后，用新鮮的去離子水室溫洗滌3遍，每次5min。加抗熒光淬滅劑后封片并在激光共聚焦顯微鏡下觀察，觀察樣品時各項參數及激發光選擇按照試劑盒要求設置。

2結果

2.1普通光學顯微鏡下全蟲形態結果見圖1。圖中個體較小蟲體為SSIF，個體較大的為MSIF。SSIF無法觀察到膨大的卵巢；兩者腸管均十分明顯，MSIF腸管更發達。MSIF消化道和卵巢光鏡下十分明顯，卵巢已經處于雌蟲中間部分。SSIF相對MSIF個體形態差別十分明顯，且未見明顯的卵巢。

2.2卵黃腺和卵巢激光共聚焦觀察在MSIF中可見卵巢中既有成熟的卵細胞也有不成熟的卵細胞，不成熟的卵細胞排列緊密，界限不清晰，而成熟的卵細胞體積大，細胞間界限清晰，細胞呈近似球狀，細胞中間可見一亮點（細胞核）。在SSIF感染中，卵巢十分小，其中未見成熟的卵細胞，所有細胞均呈現為一圓亮點，細胞間界限不明顯（圖2）。兩者的卵黃腺，同樣有著明顯的差異，MSIF可見靠近表皮處有著顆粒狀，排列緊密但界限明確的成熟細胞，而SSIF無法觀察到顆粒狀的成熟細胞，如卵巢一樣只能看到界限不明晰的亮點，即無法觀察到成熟的卵黃腺細胞。所觀察結果與文獻[7]報道相符。

2.3卵黃腺透射電鏡觀察MSIF卵黃腺細胞（圖3A）貼近基膜處細胞細胞核核仁十分明顯，卵黃腺細胞中還觀察到明顯的卵黃滴（Vd），里面有數十個卵黃球（圖3B）；而SSIF卵黃腺細胞貼近基膜處細胞細胞核核仁（Nu）不明顯，同時在卵黃腺中僅發現形成囊泡的脂滴，沒有發現形成囊泡的卵黃滴。

2.4TUNEL凋亡檢測結果在對卵黃腺切面的觀察中，兩個樣本的凋亡觀察均不是十分明顯，整個切面僅能觀察到數個不等的綠色熒光點（圖4）。部分切片甚至沒有觀察到綠色熒光點（圖片未呈現）。

3討論

早期研究表明，單性感染雌蟲由于缺乏來自雄蟲的刺激而維持在性發育阻遏狀態。Serah等[8]通過對曼氏血吸蟲雌蟲卵黃腺細胞的分化和凋亡觀察，認為SSIF的滯育是由于卵黃腺細胞的凋亡造成的，但其卵黃腺細胞的分化則與MSIF并無顯著差異。此研究結論與Den等[9]早期對MSIF與SSIF蟲體DNA合成情況的比較研究結果不同。Den等[9]研究發現單性感染的滯育雌蟲的DNA合成顯著低于性發育正常雌蟲，即SSIF雌蟲卵黃腺細胞的分化程度顯著低于MSIF。本研究利用TUNEL法，對正常生理狀態的SSIF和MSIF蟲體卵黃腺的凋亡水平進行觀察比較，結果發現二者凋亡水平均不明顯，且二者間并不存在明顯的凋亡狀態的差異，此結論與Serah等[8]觀點相左。血吸蟲正常發育雌蟲為維持每日大量產卵的需求，需大量卵黃細胞持續不斷地產生與成熟（每個蟲卵需由一個受精卵細胞及約20個卵黃細胞配備而成），大量卵黃細胞的產生和成熟必然伴隨DNA的大量合成。同時，滯育雌蟲由于不需要形成大量的成熟的卵黃細胞，其DNA合成水平低下在情理之中，在沒有大量卵黃細胞的形成前提下，自然也無需進行大量的凋亡消耗掉這些細胞，這也符合生命活動的最有效性，我們的觀察也佐證了此點。

卵黃細胞的發育過程分為四個時期，在細胞成熟的過程中最為明顯的變化是形成卵黃滴，而脂肪酸是卵黃滴的主要成分[4]。脂肪酸是雌蟲卵黃腺的重要能量來源，它不僅為雌蟲卵黃腺細胞的成熟提供營養支持，還能夠為卵黃細胞在蟲卵中發揮作用提供大量的能量儲備，因此脂滴的形成對產生正常蟲卵有十分重要的作用[10]。本研究通過對雌蟲及其卵黃腺細胞形態的觀察發現：滯育雌蟲的卵黃腺及其卵巢均未得到良好的發育，MSIF的卵黃細胞內形成了明顯的卵黃滴，而SSIF的卵黃細胞內雖也有呈一定程度聚集的脂滴，但并未形成典型的囊泡狀的卵黃滴。透射電鏡也發現，SSIF蟲體卵黃細胞不具備成熟細胞的特征，具體表現在核仁的形態上。核仁與蛋白合成密切相關，核仁狀態一定程度上反應了細胞的代謝活動[11]。代謝活動強，蛋白合成能力強的細胞核仁明顯，而多處于靜止期的細胞如肌細胞等核仁則不明顯[12]。CLMS結果也表明SSIF蟲體在卵巢和卵黃腺中，不存在類似于MSIF的成熟細胞。

由此可見，SSIF的卵黃細胞絕大部分處于不成熟狀態，其代謝活動較弱，未進行充分的發育；同樣的情況也表現于卵巢，SSIF卵巢也無發育成熟的卵細胞，這也說明滯育雌蟲處于待成熟狀態。血吸蟲正常發育雌蟲產生大量蟲卵是血吸蟲造成宿主病理損害和血吸蟲病傳播的關鍵，血吸蟲生殖發育機理的研究有可能對揭示血吸蟲性成熟機制及研制抗血吸蟲生殖疫苗或藥物提供重要理論依據。本研究從形態和結構上簡單比較了MSIF和SSIF的差異，為后續MSIF和SSIF發育差異機制研究提供了形態學方面的基礎。

作者：韓愉 喬洪賓 曹宇凡 陸珂 李浩 劉金明 林矯矯 金亞美 單位：中國農業科學院上海獸醫研究所 農業部動物寄生蟲學重點開放實驗室