中藥方劑發(fā)酵前后成分分析范文
本站小編為你精心準(zhǔn)備了中藥方劑發(fā)酵前后成分分析參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。
1.1色譜條件色譜柱ChromsphereC18柱(150mm×4.6mm，5μm)、流相乙腈-水-甲醇(7:2:1)、流速0.8ml/min、檢測波長268nm、柱溫室溫、進(jìn)樣量20μl。
1.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置精密稱取甘草次酸對照品約10mg，用甲醇適量超聲溶解，加甲醇至刻度，搖勻，配成甘草次酸對照品溶液。再精密吸取0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml，置量瓶中，配成各個濃度的甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別取各個濃度的甘草次酸對照品溶液20μL，依次進(jìn)樣，測定峰面積，記錄色譜圖及色譜峰面積，以進(jìn)樣量(μg)對峰面積進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1341206.1X+87543.5(相關(guān)系數(shù)r=0.9996)，線性范圍為0.0768~1.2288μg。
1.4樣品處理方法中藥提取液、發(fā)酵液的處理方法：分別取中藥提取液和發(fā)酵液10ml，加入5%的鹽酸20ml，搖勻10min，分別離心10min，6000r/min。取上清液10ml，用氯仿萃取3次，20ml/次。合并萃取液，蒸干，用甲醇溶解，定容到50ml容量瓶中。
1.5精密度試驗取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣20μl，記錄吸收峰面積，測定結(jié)果RSD為0.22%。
1.6穩(wěn)定性試驗取供試樣品溶液，室溫放置，每2h上樣1次，記錄鋒面積，測定結(jié)果RSD為1.87%。說明樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定。
1.7重現(xiàn)性試驗根據(jù)樣品處理方法，分別制備供試樣品，每個樣品制備6分。分別測定含量，測定結(jié)果藥渣的RSD為1.74%，發(fā)酵產(chǎn)物的RSD為1.58%。
1.8加樣回收試驗取已知含量的提取液和發(fā)酵產(chǎn)物樣品，精密稱定5份，置于錐形瓶中，分別加入甘草次酸對照品溶液，分別處理樣品。測定樣品中甘草次酸含量，結(jié)果如表1、2。
1.9含量測定按照設(shè)定的色譜條件和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，提取液和發(fā)酵產(chǎn)物中各3批產(chǎn)品中甘草次酸的含量，結(jié)果如表3。
2發(fā)酵前后黃芩苷、黃芩素的變化
2.1色譜條件色譜柱ChromsphereC18柱(150mm×4.6mm，5μm)、流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液(51:49)、檢測波長277nm、流速1.0ml•min-1、柱溫25℃，理論塔板數(shù)按黃芩苷峰，黃芩素峰計算應(yīng)不低于2500。
2.2對照品溶液的制備黃芩苷對照品溶液制備：取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1ml含25μg黃芩苷的對照品溶液，搖勻，既得。黃芩素對照品溶液制備：取黃芩素對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1ml含100μg黃芩素的對照品溶液，搖勻，既得。
2.3供試樣品的制備中藥提取液、發(fā)酵液的處理方法：分別取中藥提取液和發(fā)酵液，分別離心10min，6000r/min。取上清液5ml，轉(zhuǎn)移置于25ml容量瓶中，加無水乙醇5ml超聲溶解，加入無水乙醇定容。從容量瓶中移取5ml至50ml容量瓶中，用70%的乙醇定容。
2.4檢測波長的確定黃芩苷與黃芩素對照品經(jīng)DAD檢測器進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，二者均在277nm處有最大吸收，故檢測波長確定為277nm。
2.5專屬性試驗按處方比例配制缺黃芩的陰性樣品，制備樣品溶液，根據(jù)色譜條件測定，結(jié)果黃芩苷和黃芩素對照峰處均未出現(xiàn)色譜峰，說明發(fā)酵液和提取液中其他成分對黃芩中黃芩苷和黃芩素的測定均無干擾。
2.6線性關(guān)系考察（1）黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取黃芩苷對照品4.08mg，置100ml量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為40.8μg/ml的溶液。分別稀釋成濃度為10.2、15.3、20.4、25.5、30.6、35.7μg/ml。精密吸取上述6個濃度對照品溶液10μl，注入液相色譜儀，按色譜條件測定峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：黃芩苷在0.102~0.357μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程Y=33309.29X+2233.611(r=0.9999)。結(jié)果見圖3。（2）黃芩素的標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取黃芩素對照品13.43mg，置25ml量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為0.537mg/ml的溶液。分別稀釋成濃度為53.7、107.4、214.8、322.2、429.6、537.0μg/ml。精密吸取上述6個濃度對照品溶液10μl，注入液相色譜儀，按色譜條件測定峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：黃芩素在0.537~5.370μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=51392.68X-666.28(r=0.9998)。結(jié)果見圖4。
2.7穩(wěn)定性試驗制備供試品溶液，室溫下放置，分別于0、1、2、4、6、8、10、12、24h后依次注入液相色譜儀，測定黃芩苷與黃芩素的峰面積并計算RSD值。黃芩苷與黃芩素的RSD分別為0.22%和0.52%，結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.8精密度試驗取樣品，制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積值并計算RSD值。黃芩苷和黃芩素的RSD分別為0.26%和0.53%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。
2.9重復(fù)性試驗取同一批號樣品，制備供試品溶液6份，測定其含量及RSD值。黃芩苷和黃芩素的含量分別為1.31mg/g(RSD=1.09%)，8.43mg/g(RSD=0.48%)。結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。
2.10回收率試驗（1）黃芩苷回收率試驗：稱取已知含量的同一批供發(fā)酵液和提取液各1ml(5份)，精密稱定，分別精密加入黃芩苷對照品，測定黃芩苷含量，計算回收率，結(jié)果見表4、5。（2）黃芩素回收率試驗：稱取已知含量的同一批發(fā)酵液1ml(5份)，精密稱定，分別精密加入黃芩素對照品，測定黃芩素含量，計算回收率。結(jié)果見表6、7。
2.11黃芩苷、黃芩素在發(fā)酵液和提取液中的含量分別取3批中藥發(fā)酵液和提取液各2ml，處理樣品，進(jìn)入高效液相，測定含量。
3結(jié)論
從試驗結(jié)果來看，發(fā)酵液和提取液中均有柴胡皂苷a,柴胡皂苷d的薄層特征，并且發(fā)酵液中的薄層點要比提取液多兩個，并且特有的斑點移動距離大于柴胡皂苷a和d，這說明這兩種物質(zhì)的極性、分子量小于柴胡皂苷，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，這兩種物質(zhì)疑似柴胡皂苷a和d的苷元。從液相測定的甘草次酸、黃芩素、甘草酸、黃芩苷的含量來看，通過發(fā)酵后甘草次酸、黃芩素含量升高，而甘草酸和黃芩苷含量降低，通過研究發(fā)現(xiàn)甘草次酸和甘草酸的區(qū)別就是，甘草次酸比甘草酸少了一個葡萄糖，而黃芩苷和黃芩素的區(qū)別也是如此，黃芩素、甘草次酸、柴胡皂苷苷元，在腸道內(nèi)可以不經(jīng)過腸道微生物的分解，直接吸收進(jìn)入血液，藥效要比黃芩苷、甘草酸、柴胡皂苷快，因此，通過生物發(fā)酵提高了中藥的藥效，加快了中藥的作用速度。
作者：范作良 劉英龍 鞠 雷 李汝春 賈慧卿 單位：山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 濰坊諾達(dá)藥業(yè)有限公司
