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《中國獸醫科學雜志》2014年第八期

1材料與方法

1．1糞樣和對照樣品本研究所用的112份流浪貓糞樣采自廣州市某寵物救助站。陽性對照樣品巴西鉤蟲為美國諾華動物保健有限公司StephenEBienhoff博士贈送。陽性對照樣品犬鉤蟲和錫蘭鉤蟲以及陰性對照樣品貓弓首蛔蟲、犬復孔絳蟲、狐毛尾線蟲蟲卵，藍氏賈第蟲包囊、貓等孢球蟲卵囊均為華南農業大學寄生蟲病教研室保存。

1．2主要試劑糞便DNA提取試劑盒為OMEGA公司產品。UNIQ－10柱式pcr產物純化試劑盒為生工生物工程（上海）股份有限公司產品。ExTaqDNA聚合酶、pMD18－T載體及JM109感受態細胞均為寶生物工程（大連）有限公司產品。

1．3顯微鏡檢查在待檢的貓糞樣品中加入2倍體積的蒸餾水攪勻，0．246mm的篩網過濾1次，吸取1～2mL過濾液于5mL離心管中，加入2倍體積蒸餾水，4000r／min離心5min，棄上清液，加入2．5mL33．3g／L的硫酸鋅溶液，攪勻，1500r／min離心3min，再加入33．3g／L的硫酸鋅溶液直至加滿離心管，其上放置一蓋玻片，靜置5min后，移開蓋玻片，放置于載玻片上，盧戈氏碘液染色，在40×10倍鏡下檢查。

1．4糞便DNA的提取吸取1．3中的糞便過濾液1．5mL于2mL離心管中，4000r／min離心5min，棄上清液，加入適量的玻璃珠并在－80℃和100℃中反復凍融5次，然后加入適量的緩沖液和蛋白酶K，漩渦振蕩30min，55℃消化16h。之后，按照糞便DNA提取試劑盒使用說明書提取蟲卵基因組DNA。

1．5PCR反應條件的優化擴增引物為鉤蟲ITS部分序列的保守引物AF：5′－CTTTGTCGGGAAGGTTGG－3′和AR：5′－TTCACCACTCTAAGCGTCT－3′［12］，預期擴增片段的大小為404bp。PCR反應體系（25μL）為：10×Buffer2．5μL，dNTP5nmol，上、下游引物各25pmol，ddH2O17．3μL，模板2μL，ExTaqDNA聚合酶0．2U。PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，51．9～69．5℃退火30s，72℃延伸45s，35個循環；72℃后延伸7min。根據不同退火溫度下目的條帶的亮度確定最佳退火溫度。

1．6特異性試驗按照1．5中的最佳退火溫度，分別取錫蘭鉤蟲、犬鉤蟲、巴西鉤蟲和陰性對照的基因組DNA2μL作為模板，同時設立滅菌雙蒸水作為空白對照進行PCR擴增，重復2次，檢測該方法的特異性。

1．7敏感性試驗測定提取的鉤蟲蟲卵基因組DNA濃度，然后按10倍倍比連續稀釋，每個倍數稀釋樣品取2μL作為模板進行PCR擴增，重復2次，檢測該方法的敏感度。

1．8PCR方法的臨床檢測對112份流浪貓糞樣進行3次碘液染色鏡檢，同時提取糞便DNA進行PCR檢測，比較兩種方法的檢出率。以3次鏡檢作為貓鉤蟲病診斷的金標準，按照診斷試驗真實性評價方法計算PCR方法的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值。計算方法如下：敏感度＝真陽性／（真陽性＋假陰性）；特異度＝真陰性／（假陽性＋真陰性）；陽性預測值＝真陽性／（真陽性＋假陽性）；陰性預測值＝真陰性／（假陰性＋真陰性）。PCR擴增后，隨機抽取5個陽性樣品進行切膠并按照膠回收試劑盒說明書回收純化PCR產物，將純化產物連接到pMD18－T載體上，連接之后的載體轉入JM109感受態細胞中，然后將連接產物均勻涂布于含有氨芐青霉素、IPTG和X－gal的固體營養瓊脂培養基上，37℃培養過夜后挑取單個菌落，37℃搖床培養6h，菌液PCR鑒定，將含有目的片段的菌液送至北京華大生物技術有限公司測序。

2結果

2．1PCR最佳退火溫度的篩選溫度梯度PCR擴增的電泳結果顯示，退火溫度為61．2℃時擴增效果最好（見圖1）。

2．2特異性試驗特異性PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，只有鉤蟲的基因組DNA樣品擴增出404bp的條帶（見圖2）。

2．3敏感性試驗經核酸測定儀測定，鉤蟲蟲卵基因組DNA的質量濃度為107．2μg／mL。重復試驗顯示，該反應體系的最低檢測限為1∶108的稀釋度，即最低可檢測1．07fg鉤蟲蟲卵基因組DNA（見圖3）。

2．4臨床初步應用兩種方法的檢測結果顯示，鏡檢法第1次的檢出率為34．8％，3次的檢出率為43．8％；PCR方法一次的檢出率為43．8％（見表1）。以3次鏡檢作為貓鉤蟲病診斷的金標準，根據公式計算，得出該PCR檢測方法的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值均為100％。測序結果顯示，5個隨機樣品的序列長度均為404bp，同源性比對發現，1個序列（登錄號：KJ840829）與GenBank中收錄的1株錫蘭鉤蟲ITS序列（登錄號：KF279136）的一致性為99％，另外4個序列（登錄號：KJ840825～KJ840828）與1株犬鉤蟲ITS序列（登錄號：KC755025）的一致性均為99％。

3討論

貓鉤蟲是一種土源性寄生蟲，其感染性幼蟲在適宜的外界環境中可存活數周，污染環境，造成宿主反復感染，對犬貓和人類的健康構成潛在威脅。目前大多采取化學防治的防控措施，但藥物治療對鉤蟲的再次感染影響甚微，并且長期的藥物驅蟲使得輕度感染越來越普遍，造成糞便鏡檢的漏檢率升高。采用重復糞便鏡檢雖然可以提高檢出率，但費時費力，特別是對于大規模的鉤蟲病流行病學調查時，過長的鏡檢還會引起糞便中蟲卵的變形或溶解。因此，急需建立一種適合臨床使用的鉤蟲敏感、特異、快速的檢測方法。內轉錄間隔區（internaltranscribedspacers，ITS）是介于核糖體18S、5．8S和28SDNA之間的區域。多項研究表明，ITS序列可以作為鉤蟲的分子標記與其他寄生蟲進行區分。因此，本研究根據鉤蟲ITS部分序列的保守引物建立了貓鉤蟲的PCR檢測方法。特異性試驗中只有貓鉤蟲擴增出目的條帶，貓的其他常見寄生蟲沒有擴增產物出現。

在敏感性試驗中，最低檢測到1．07fg鉤蟲基因組DNA。上述結果表明該方法具有較高的特異性和敏感性。在對112份臨床貓糞的檢測中，PCR方法的檢出率比首次糞便鏡檢高9％，而與重復3次的鏡檢結果一致。近年來，越來越多的PCR檢測技術已應用于人鉤蟲病的診斷，顯示了較高的敏感性和特異性。Schr等比較了糞便鏡檢法和PCR方法對人體鉤蟲的檢出率，結果PCR方法的檢出率比糞便鏡檢法高11％。Wang等應用糞便鏡檢法和兩種PCR方法同時對人糞便中的美洲鉤蟲進行檢測，結果顯示兩種PCR方法均較糞便鏡檢法敏感。本試驗中，以3次鏡檢作為貓鉤蟲病診斷的金標準時，PCR方法的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值均達到了100％。5個隨機樣品的測序結果顯示序列長度均為404bp，同源性比對發現5個序列與GenBank中收錄的錫蘭鉤蟲和犬鉤蟲的ITS序列一致性達99％，說明擴增結果正確。另外，該方法運用試劑盒，僅對糞便進行簡單處理即可快速簡便地提取糞便中的鉤蟲蟲卵DNA，提高了檢測效率。臨床初步應用結果說明，該方法適用于鉤蟲病的流行病學調查和臨床診斷。

作者：胡偉劉遠佳鄭國超譚立娉羅琴李國清單位：華南農業大學獸醫學院