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《中國預防獸醫學報》2014年第八期

1材料和方法

1.1動物免疫1日齡非免疫雛雞共60只，飼養至4周齡時隨機平均分為3組，分別為rPtfA組、弱毒活疫苗組和PBS對照組。弱毒活疫苗組肌肉注射1羽份/只，PBS對照組皮下多點注射0.5mL/只，rPtfA組在初次免疫時以純化的rPtfA蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合進行乳化，皮下多點注射0.5mg/只，2免和3免時以純化的rPtfA蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合進行乳化，皮下多點注射0.5mg/只。以上3組均免疫3次，每次間隔2周。

1.2免疫抗體檢測免疫后每周采血，分離血清，以禽P.multocida菌懸液為包被抗原，以兔抗雞IgG-HRP為二抗進行間接ELISA試驗測定血清抗體水平，測定OD490nm值，從初免后第1周進行檢測，共檢測6周。

1.3外周血T淋巴細胞增殖試驗各免疫組雛雞分別于初免后第2周、第4周、第6周無菌心臟采血，分離外周血淋巴細胞，進行MTT試驗測定外周血T淋巴細胞的增殖水平。試驗設檢測孔和對照孔，檢測孔以ConA蛋白為刺激物，對照孔不加刺激物，反應結束后測定OD570nm值，計算刺激值SI(SI=OD檢測孔/OD對照孔)。

1.4IFN-γ分泌水平檢測每次免疫2周后，采血分離外周血淋巴細胞，調整濃度為1×107個/mL。按上述同樣方法制備ConA蛋白誘導的外周血淋巴細胞，37℃5%CO2培養72h后，吸取培養上清液離心收集后-20℃保存。按照雞IFN-γ檢測試劑盒制作標準曲線，對各組免疫雞分泌的IFN-γ進行檢測。

1.5攻毒保護試驗3免后2周時，各組免疫雞肌肉注射禽P.multocida強毒CVCC474菌株進行攻毒，5LD50/只，觀察2周，記錄各組實驗動物的死亡數量，計算各免疫組的存活率并按照如下公式計算各組的保護率：保護率=(免疫組雞存活率-對照組雞存活率)/100%。

2結果

2.1重組蛋白的純化將重組菌經IPTG誘導表達后，利用His-Tag融合蛋白純化試劑盒對重組蛋白進行純化，進行SDS-PAGE分析。結果顯示，純化的rPtfA分子量約為33ku，與預期大小一致(圖1)。

2.2血清抗體檢測結果以禽P.multocida全菌體作為包被抗原進行間接ELISA試驗檢測各免疫組雞血清IgG抗體水平，從首免后1周進行檢測，共檢測6周。結果顯示，弱毒活疫苗組和rPtfA免疫組的血清抗體水平呈逐漸上升趨勢，與PBS對照組相比差異極顯著(p<0.01)，而且弱毒活疫苗組的血清抗體水平略高于rPtfA免疫組，但差異并不顯著(圖2)。

2.3MTT檢測結果首次免疫后每隔2周，心臟采血制備免疫雞外周血淋巴細胞懸液，以ConA蛋白進行刺激，MTT法檢測其增殖情況。結果顯示，rPtfA組和弱毒活疫苗組均出現增殖反應。第2周時各組的SI值差異不顯著，第4周和第6周時rPtfA組和弱毒活疫苗組的SI值極顯著高于PBS對照組(p<0.01)，并且弱毒活疫苗組稍高于rPtfA免疫組(圖3)。

2.4IFN-γ分泌水平分別于首免疫后的第2周、第4周和第6周時，制備免疫雞外周血淋巴細胞懸液，以ConA蛋白進行誘導，收集上清液，檢測上清液中IFN-γ的含量，結果顯示，首免后第2周兩疫苗組和PBS對照組分泌的IFN-γ無明顯差異；4周和第6周時兩疫苗組免疫雞外周血淋巴細胞分泌的IFN-γ的量顯著高于PBS對照組(p<0.01)，雖然兩疫苗組差異并不顯著，但弱毒活疫苗組分泌的IFN-γ水平要稍高于rPtfA免疫組(圖4)。

2.5攻毒保護結果各組實驗動物于第3次免疫后2周時以禽P.multocida強毒株進行攻擊。繼續飼養觀察2周，計算疫苗的保護率，結果顯示rPtfA組和弱毒活疫苗組的保護率均明顯高于PBS對照組，并且弱毒活疫苗組高于rPtfA組，各組存活數及保護率如表1所示。

3討論

禽P.multocida引起的禽霍亂是影響禽類健康的重要疫病之一，用于預防該病的傳統疫苗存在免疫期短，副作用較大等一系列問題，因此需要研制新型有效的疫苗。本實驗構建了禽P.multocida菌毛蛋白編碼基因ptfA的原核表達載體，在大腸桿菌感受態細胞中進行了表達，并對表達的重組蛋白進行了純化。為進一步研究該重組蛋白的免疫原性，本實驗利用該重組蛋白制備了油乳劑疫苗，進行了動物免疫和攻毒試驗，檢測了該重組疫苗誘導實驗動物機體產生的體液和細胞免疫應答水平以及為實驗動物提供的保護效果，從而為研制新型禽P.multocida基因工程亞單位疫苗提供了一定的參考。將制備的rPtfA亞單位疫苗免疫雞后，通過間接ELISA試驗檢測了該疫苗誘導的抗體應答水平，結果表明該重組亞單位疫苗可以刺激機體產生一定水平的血清抗體。由于弱毒活疫苗所含成分較為復雜，利用其免疫動物后誘導機體產生的抗體是針對多種抗原成分的抗體混合物，而rPtfA亞單位疫苗成分較為單一，刺激動物機體產生的抗體主要針對于該重組蛋白。

實驗中所用包被抗原為禽P.multocida全菌體，其中所含抗原成分與弱毒活疫苗較為接近，這可能是檢測到弱毒活疫苗誘導的抗體水平高于rPtfA亞單位疫苗的原因之一。此外，本實驗對疫苗免疫動物后的淋巴細胞增殖水平及IFN-γ分泌水平也進行了測定，結果表明該重組亞單位疫苗可以在一定程度上誘導免疫動物產生細胞免疫應答，但水平要低于弱毒活疫苗。為保證攻毒效果，采用5LD50的劑量以禽P.multocida強毒株進行攻毒后，結果各組的實驗動物均出現一定數量的死亡，其中PBS對照組死亡數最多，但攻毒2周后該組仍有1只實驗動物存活。分析其中的原因可能與實驗動物的個體差異有一定的關系，也可能與動物的飼養環境有關系，本實驗的動物飼養于微生物實驗室中，該實驗室保存有多種病原微生物、工業微生物和食品微生物。可能在飼養過程中有一部分此類微生物通過自然途徑進入實驗動物體內，若其中的某些微生物含有與禽P.multocida具有一定同源性的蛋白成分，則動物機體可能對此產生了一定程度的免疫應答，從而對禽P.multocida具有了一定的抵抗力。因此，在今后的動物實驗過程中應重視飼養環境的潔凈，以保證實驗結果的準確性。攻毒后rPtfA組的保護率明顯不及傳統的弱毒活疫苗，其原因可能在于該重組蛋白所含抗原成分較為單一或者禽P.multocida菌毛蛋白的免疫原性不夠強，不足以為實驗動物提供較強保護力。因此，后續研究可嘗試將ptfA基因與禽P.multocida的其他保護性抗原基因連接后制備多基因融合亞單位疫苗，以期提高其免疫效果。

作者：宮強孔梁宇牛明福秦翠麗侯穎孫曉菲單位：河南科技大學