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《中國預防獸醫學報》2014年第八期

1材料和方法

1.1病毒標準品的制備及檢測抗體的標記將EAVBucyrus株接種于RK-13單層細胞，細胞病變(CPE)達80%以上時收獲病毒，反復凍融3次，2000r/min離心30min，除去細胞碎片，收取上清液。上清液倍比稀釋后接種于RK-13細胞，48h初步判定，72h最終判定，測得病毒上清液的毒價為10-5.5TCID50/100μL。將病毒上清液與0.5%TritonX-100混合，室溫靜置15min，12000r/min，4℃離心10min，上清液即為病毒標準品。辣根過氧化物酶標記的MAb2B3(HRP-2B3)由天津三箭生物技術公司標記，分裝保存于-20℃。

1.2DAS-ELISA檢測方法的建立

1.2.1操作程序利用pH7.6的PBS稀釋純化的MAb2B9包被酶標板，100μL/孔，4℃過夜，采用0.05%Tween-20的PBS(PBST)洗板3次，每次3min；5%脫脂乳封閉酶標板，37℃2h，洗板；加病毒標準品和陰性對照(RK-13細胞上清液)，100μL/孔，37℃1h，洗板；HRP-2B3孵育酶標板，37℃1h，洗板；通過TMB使底物顯色，100μL/孔，37℃10min；最后以2M濃硫酸50μL/孔終止反應，測定OD450nm值。

1.2.2最佳反應條件的選擇在不同反應條件下，對捕獲抗體包被量(8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL)，抗原的工作濃度(1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶100、1∶200、1∶300)，HRP-2B3稀釋度(1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000)，病毒標準品、捕獲抗體、檢測抗體(0.5h、1h、1.5h、2h)及TMB最佳作用時間(5min、10min、15min、20min)，封閉液的種類(10%BSA、5%小牛血清、5%脫脂奶粉)進行ELISA試驗，檢測同一陽性和陰性樣品。選擇陰性OD450nm值小于0.1，P/N值最大的條件為最佳條件。

1.2.3判定標準的確定取不同批次傳代的RK-13細胞，收集上清液作為陰性樣品，進行ELISA檢測，同時設立陽性對照。計算被檢RK-13細胞上清液的平均OD450nm值(X)和標準差(SD)，陽性臨界值=陰性樣品X+3SD。

1.2.4定量DAS-ELISA標準曲線的建立病毒標準品經1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶100、1∶200、1∶300稀釋，采用優化的DAS-ELISA方法進行試驗，反應完畢測定OD450nm值。以TCID50值為橫坐標，OD450nm值為縱坐標，繪制標準曲線，確定相關系數和線性關系式。

1.3特異性檢測應用建立的DAS-ELISA方法對實驗室保存的EIAV、EIV、EHV-1和EHV-4進行檢測，確定該方法的特異性。

1.4敏感性檢測病毒標準品以1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶100、1∶200、1∶300稀釋，經DAS-ELISA方法檢測，確定該方法的最低檢出限。

1.5穩定性檢測3次包被的酶標板重復檢測不同TCID50的EAV細胞上清液，比較結果，評價該方法的穩定性。

2結果

2.1DAS-ELISA檢測方法反應條件的優化以MAb2B9為捕獲抗體包被酶標板，MAbHRP-2B3為檢測抗體；通過方陣試驗確定MAb2B9的最佳包被濃度為2μg/mL，最佳包被時間是4℃12h；MAbHRP-2B3的最佳工作濃度為2μg/mL，最佳反應時間為1h；抗原最佳工作時間為37℃1h；3種封閉液(10%BSA、5%小牛血清、5%脫脂奶粉)的封閉效果均比較理想，選用5%脫脂奶粉作為封閉液，37℃2h封閉效果最好；TMB顯色最佳時間為10min(表1)。

2.2DAS-ELISA判定標準的確定采用20份不同批次傳代的RK-13細胞上清液作為陰性樣品，進行ELISA檢測。經統計學處理，樣品的X和SD值分別為0.0087和0.012，根據公式X+3SD計算，陽性結果判定標準的臨界值為0.124，即OD450nm值≥0.124判為陽性。

2.3定量DAS-ELISA標準曲線抗原的TCID50值和其經DAS-ELISA檢測的OD450nm值之間呈線性關系，線性方程為y=5×10-5x+0.0651，R2為0.9982(圖1)。

2.4特異性試驗以DAS-ELISA方法檢測EAV、EIAV、EIV、EHV-1和EHV-4，僅EAV的檢測值OD450nm>0.124(圖2)，表明該方法在檢測其他病毒時無交叉反應，特異性好。

2.5敏感性試驗病毒標準品以PBS做1∶5～1∶300稀釋，應用建立的ELISA方法對其進行檢測。1∶200稀釋時，OD450nm值為0.131>0.124，1∶300稀釋時，OD450nm值為0.096<0.124，表明該方法的最低檢出限為1∶200(103.2TCID50)。2.6穩定性試驗3塊不同的酶標板(1、2、3)對倍比稀釋的病毒標準品的檢測重復性良好，并且呈線性分布，表明該方法的穩定性好。

3討論

雖然近年來我國尚未有分離到EAV的報道，但賽馬業的迅速發展，馬匹交流的頻繁，增加了EVA的傳播風險。OIE指定用于國際貿易中檢測EAV的方法是VN[11]。VN應用于確診可疑馬，篩選種公馬是否感染EAV，具有良好的特異性和較高的敏感性，但該方法操作復雜，耗時長，不易于大批量樣品的檢測。現有的ELISA方法中，MAb阻斷ELISA方法操作簡單，成本較低，但病毒抗原的制備較為復雜，很難保證批次的穩定性。本實驗建立的DAS-ELISA方法能夠特異性地檢測EAV，與EIAV、EIV、EHV-1和EHV-4呈現明顯的陰性反應，操作簡單、試驗周期短，可以同時檢測大批樣本。并且該DAS-ELISA方法具備極好的穩定性，包被的酶標板在-20℃冰箱保存一個月，其敏感性和特異性均未變。由于臨床樣本中未發現感染EVA的病例以及馬匹動物實驗實施的不便，無法開展該方法和其他方法的比較試驗，但實驗室階段的研究工作已經成熟，為后期診斷試劑盒的開發提供良好的實驗基礎。該方法對口岸及養馬場中馬匹的快速檢測、疫情的發現和控制具有十分重要的意義。

作者：胡月戚亭趙世華關平原王曉鈞單位：內蒙古農業大學獸醫學院/農業部動物疾病臨床診療技術重點實驗室中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室/馬傳染病與慢病毒創新團隊