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《中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報》2014年第八期

1實驗步驟

1.1CSN的制備采用油包水的反相微乳液法合成CSN[11]。通過正硅酸乙酯(TEOS)的水解和縮聚反應(yīng)，并以TritonX-100、正己醇、環(huán)己烷分別為表面活性劑、助表面活性劑和有機溶劑，氨水作為催化劑，制備二氧化硅納米微球；為合成彩色微球，在反應(yīng)過程中分別加入活性大紅3G、活性橙黃X-GN、活性藍綠(活性翠蘭KN-G與活性嫩黃4GLN按1∶1調(diào)配)等有機活性染料各150μL；為消除二氧化硅納米微球之間的團聚，加入20μL硅烷偶聯(lián)劑KH-550在微球表面引入氨基，增大表面電位以促進微球之間的分散度，形成單分散彩色微球。連續(xù)反應(yīng)48h后用丙酮破乳、離心并收集顆粒，將得到的CSN分散在5mL超純水中備用。

1.2CSN的粒徑和形貌表征采用場發(fā)射掃描電鏡SU-70和Nano2S激光粒度電位儀對各參數(shù)下制備的二氧化硅納米微球的粒徑和形貌進行表征。

1.3CSN的活化將合成的CSN用超純水清洗三次，分散到20mL水中超聲10min使微球均勻分散，分別加入1.4mL冰乙酸和0.2mL的APTE攪拌均勻后持續(xù)震蕩反應(yīng)1h。將反應(yīng)后的微球用水清洗3次，分散到10mL琥珀酸酐和DMF的混合溶液中在通氮氣條件下持續(xù)振蕩反應(yīng)5h，離心、清洗后即可得到富含羧基的活性微球，將其4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4ICSN的制備及反應(yīng)原理配制pH6.8濃度為0.1mol/L的嗎啉乙磺酸緩沖液(MES)，在5mLMES緩沖液中分別加入500mg的N-羥基丁二酰亞胺和500mg的DEHE，加入活化后的CSN室溫下反應(yīng)1h。離心后得到的微球分散到pH7.3濃度0.1mol/LPBS中。取10mL分散的活化微球與10μLE.sakazakii凝集抗體，室溫下孵育4h，用PBS清洗、離心后得到ICSN，分散到5mLPBS中，4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5制備抗原制取一定濃度的E.sakazakii菌液，將其用0.4%甲醛溶液滅活，并進行滅活檢測，確定滅活后稀釋成所需濃度。

1.6不同ICSN凝集試驗將不同顏色的ICSN各10μL分別與等量的待測抗原滴加在潔凈的凹圓載玻片上，混勻至抗原抗體充分反應(yīng)，在1min～3min內(nèi)觀察凝集現(xiàn)象，同時設(shè)陰性對照，除特別說明以外的其它凝集反應(yīng)均在室溫(22℃±2℃)下進行。

1.7ICSN的特異性將標(biāo)記E.sakazakii抗體的ICSN分別與濃度相同的E.sakazakii、S.pullorum&gallinarum、E.coli、S.flexneri進行凝集試驗，用生理鹽水做陰性對照，觀察凝集現(xiàn)象。

1.8ICSN的敏感性用ICSN分別與濃度為6×101cfu/mL～6×109cfu/mL的E.sakazakii進行凝集試驗，并以生理鹽水為陰性對照，觀察凝集效果，評價其敏感性。

1.9凝集反應(yīng)最適溫度的選擇取10μL藍色ICSN與10μLE.sakazakii，分別在溫度為0℃、22℃、37℃、45℃和60℃條件下進行凝集反應(yīng)，觀察凝集效果，以確定出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象的最適溫度。

1.10穩(wěn)定性將制備的ICSN在4℃條件下放置30d，而后取出室溫放置，使其溫度達到室溫，觀察與E.sakazakii的凝集效果，測其儲存穩(wěn)定性。

2結(jié)果

2.1CSN的制備研制的單分散彩色二氧化硅納米活性微球如圖2所示。圖2A為活性大紅3G、活性橙黃X-GN、活性嫩黃4GLN、活性綠(活性翠蘭KN-G與活性嫩黃4GLN按1∶1調(diào)配)、活性翠蘭KN-G、活性芷青GD和活性紫KN-4R染色后的7種顏色的CSN；圖2B為合成的CSN的掃描電鏡圖，由圖可知，這些彩色微球的形狀規(guī)則、大小均一(約70μm)、表面光滑并且具有較好的分散性。

2.2ICSN凝集試驗分別用藍色、黃色和紅色3種顏色的ICSN與E.sakazakii菌懸液進行凝集反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果如圖3所示。以3種不同顏色的ICSN分別與E.sakazakii的玻片凝集反應(yīng)，在1min～3min均出現(xiàn)明顯的團狀或絮狀凝集現(xiàn)象，液滴變得澄清，凝集現(xiàn)象醒目、直觀及易于判別(圖3A、B、C)。表明ICSN具有很好的免疫凝集特性，并且3種不同顏色的ICSN均具有同樣良好的凝集效果，即不同種顏色有機活性染料對ICSN與抗原的凝集反應(yīng)過程均無可見影響，染料只起顯色、醒目的效果。而在ICSN中加入生理鹽水可以觀察到微球均勻分散在液滴中，無任何凝集塊出現(xiàn)，表明包被抗體的ICSN既不與生理鹽水發(fā)生反應(yīng)，也無自凝現(xiàn)象。

2.3ICSN的特異性為考察基于ICSN的新型凝集試驗的特異性，本研究選用了3種常見致病菌分別與E.sakazakii修飾的ICSN進行凝集試驗，并以生理鹽水為陰性對照，結(jié)果顯示，標(biāo)記E.sakazakii抗體的藍色ICSN僅與E.sakazakii發(fā)生凝集反應(yīng)，與S.pullorum&S.gallinarum、E.coli、S.flexneri均未發(fā)生凝集，用生理鹽水做陰性對照，表明ICSN具有良好的特異性。

2.4ICSN敏感性測定采用藍色ICSN與不同濃度E.sakazakii菌液的凝集結(jié)果顯示，當(dāng)菌液濃度為6×109cfu/mL和6×108cfu/mL時，出現(xiàn)粗大凝集塊，液滴澄清，凝集現(xiàn)象清晰、醒目，凝集結(jié)果判定為++++；當(dāng)菌液濃度為6×107cfu/mL和6×106cfu/mL時，出現(xiàn)粗大凝集塊，液滴有少量渾濁，凝集現(xiàn)象清晰醒目，判定為+++；當(dāng)菌液濃度為6×105cfu/mL、6×104cfu/mL和6×103cfu/mL時，出現(xiàn)較明顯的凝集塊，液滴較渾濁，判定為++；當(dāng)菌液濃度為6×102cfu/mL時，顯示肉眼可見的輕微凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，液滴渾濁，凝集結(jié)果判定為±；濃度為6×101cfu/mL的菌液和生理鹽水中未觀察到凝集現(xiàn)象(圖5)。結(jié)果表明，ICSN具有較好的靈敏度，對E.sakazakii的檢測范圍為6×103cfu/mL～6×109cfu/mL。

2.5凝集反應(yīng)最適溫度的選擇凝集試驗是基于抗原與抗體之間的特異性反應(yīng)，其中抗體的活性是凝集試驗的效果好壞的關(guān)鍵，在各種因素中反應(yīng)溫度對抗體活性的影響較為明顯(圖6)。圖6結(jié)果顯示，22℃～37℃的條件下，ICSN與E.sakazakii最先發(fā)生明顯的凝集反應(yīng)，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象較快，僅為20s～30s，凝集效果清晰、醒目，并且該溫度接近室溫，便于操作，因此選擇22℃～37℃為最佳凝集反應(yīng)溫度。當(dāng)溫度為45℃和60℃時，凝集現(xiàn)象依次減弱，這與常規(guī)凝集試驗相同。

2.6穩(wěn)定性試驗4℃放置30d后的3種顏色的ICSN的凝集效果與儲存前無顯著差異，表明ICSN的穩(wěn)定性好。

3討論

本研究應(yīng)用二氧化硅活性微球與有機活性染料共價結(jié)合制成CSN作為新型凝集試驗的載體。二氧化硅活性微球具有穩(wěn)定、不溶脹、耐儲存、生物相容性好和經(jīng)濟易得等優(yōu)點，近年來在分析檢測領(lǐng)域備受關(guān)注[12-14]。由于二氧化硅微球無色，作為間接凝集試驗的載體其凝集結(jié)果不夠清晰、直觀，影響檢測方法的敏感性和準(zhǔn)確性，若使其帶有鮮艷的顏色，則可以克服上述不足而成為間接凝集試驗理想的載體。因此，如何給微球染色則成為制備理想間接凝集試驗載體的關(guān)鍵。有機活性染料色彩豐富，生物相容性好，在光照、高溫、強酸、強堿等惡劣條件下穩(wěn)定、不退色，并且自身具有活性基團可以和氨基、羥基以及羧基發(fā)生化學(xué)作用。本研究將二氧化硅活性微球與有機活性染料通過共價結(jié)合制成CSN，既克服了白色二氧化硅微球的不足，又能充分利用該微球和有機活性染料的雙重優(yōu)勢，研制的彩色微球具有分散性好、不溶脹、色彩鮮艷、性能穩(wěn)定、生物相容性好等優(yōu)點，并能夠作為理想的凝集試驗載體。采用E.sakazakii抗體修飾CSN可制成ICSN，并基于該ICSN構(gòu)建一種新型凝集技術(shù)。該新型凝集技術(shù)靈敏度高，反應(yīng)現(xiàn)象清晰、醒目，易于判別，對E.sakazakii的檢測范圍為6×103cfu/mL～6×109cfu/mL；檢測速度快，檢測時間在22℃～37℃下僅為20s～30s，明顯快于常規(guī)凝集試驗的數(shù)分鐘；特異性和準(zhǔn)確性較好，ICSN僅與E.sakazakii發(fā)生凝集反應(yīng)，與其它致病菌試驗菌種均無可見凝集現(xiàn)象；穩(wěn)定(4℃放置30d后未見發(fā)生溶脹、褪色、自凝等變化，凝集效果與儲存前無顯著差異)、簡便并且經(jīng)濟。利用ICSN構(gòu)建的新型凝集技術(shù)，不僅可用于E.sakazakii的快速檢測，也可以擴展研究用于其它致病微生物的快速檢測。

作者：楊磊趙廣英竇文超單位：浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院浙江省食品安全重點實驗室