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《中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報》2014年第八期

1材料和方法

1.1拯救病毒電鏡觀察將固定于2.5%戊二醛溶液的rH4AGtB、rH4AH4B及rH4AHuB法氏囊組織進(jìn)行冰凍切片觀察，以觀察切片組織中是否存在晶格樣排列的病毒粒子。

1.2拯救病毒RT-PCR鑒定從拯救病毒的法氏囊組織中提取RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，分別利用引物AU/F6VP2Q1512L(5''''-GGATACGATCGGTCTGACCCCGGGGGAGTC-3''''/5''''-CTTCAGGGGAGAGTTGAGGTC-3'''')、BU/B1344L(5''''-GGATACGATGGGTCTGACCCTCTGGGA-3''''/5''''-TCTAGGTCAATTGAGTACCAC-3'''')進(jìn)行A和B節(jié)段擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物測序分析。

1.3拯救病毒ELD50的測定以PBS將拯救的病毒10倍遞次稀釋，選取10-2～10-76個稀釋度，分別接種9日齡SPF雞胚絨毛尿囊膜，每個稀釋度接種5個雞胚，連續(xù)培養(yǎng)觀察7d，剔除24h內(nèi)死亡的雞胚，按Reed-Muench法計算接種其ELD50。

1.4動物試驗設(shè)計將3周齡SPF雞隨機(jī)分為4個組，每組15只。試驗組1～3分別接種103ELD50的rH4AGtB、rH4AH4B、rH4AHuB，對照組接種相同體積的DMEM。接毒后7d內(nèi)，每天觀察實驗雞的臨床癥狀，記錄各試驗組接種雞的死亡情況，計算其死亡率。接毒后第7d，迫殺各組雞只，觀察法氏囊病變，稱取每只雞的體重及囊重，計算囊指數(shù)(BBIX)；取部分法氏囊組織用10%中性福爾馬林固定，進(jìn)行病理組織學(xué)分析。提取接毒后第4d收集法氏囊組織的RNA，進(jìn)行病毒含量的測定。

2結(jié)果

2.1拯救病毒法氏囊眼觀病變將含有ibdv的A和B節(jié)段的重組質(zhì)粒以不同組合轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞72h后，再接種于SPF雞的法氏囊中，與對照組相比，rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB接種雞法氏囊出現(xiàn)明顯萎縮現(xiàn)象，個別法氏囊呈“紫葡萄”樣，法氏囊內(nèi)有明顯的出血斑點，含有大量粘液或炎性滲出物(圖略)。

2.2拯救病毒電鏡觀察利用電子顯微鏡觀察rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB感染雞法氏囊組織制備的冰凍切片，均可以在視野中觀察到IBDV病毒粒子呈“晶格”樣排列(圖2)。

2.3拯救病毒RT-PCR檢測以rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB接種雞法氏囊中提取RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增獲得預(yù)期大小為1400bp、1340bp的IBDVA和B節(jié)段部分片段(圖略)。測序顯示：拯救病毒基因組序列與構(gòu)建克隆序列完全一致。

2.4拯救病毒ELD50的測定測定結(jié)果表明，rH4AH4B、rH4AHuBELD50相同，均為107.5/mL，第4d為兩者的死亡高峰期，rH4AH4B死亡雞胚數(shù)量為10枚，rH4AHuB為13枚；另外，rH4AHuB10-2～10-4稀釋度的雞胚接種后第4d全部死亡，但rH4AH4B僅10-2稀釋度的雞胚全部死亡。rH4AGtBELD50為105.33/mL，該病毒引起接種雞胚死亡時間有所推遲，接種后第6d、第7d仍有雞胚死亡。

2.5拯救病毒體內(nèi)復(fù)制滴度的測定與3個試驗組相比，對照組中未檢測到任何IBDVRNA拷貝數(shù)，與實際相符。rH4AH4B、rH4AHuB試驗組RNA的拷貝數(shù)高于rH4AGtB，但前者與rH4AGtB無明顯差異(p>0.05)，后者與rH4AGtB之間存在明顯差異(p<0.05)。

2.6拯救病毒試驗雞囊指數(shù)(BBIX)rH4AGtB、rH4AH4B、rH4AHuB3個試驗組接種雞BBIX均低于0.7(圖4)，表明其法氏囊均出現(xiàn)嚴(yán)重的萎縮現(xiàn)象，但各試驗組之間的BBIX無明顯差異(p>0.05)。

2.7拯救病毒對雞法氏囊組織病理學(xué)變化rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB3個試驗組接種雞法氏囊均出現(xiàn)明顯的病理變化，淋巴濾泡內(nèi)淋巴細(xì)胞壞死崩解或消失，多數(shù)濾泡內(nèi)淋巴細(xì)胞消失不見，間質(zhì)小血管嚴(yán)重淤血，成纖維細(xì)胞增生，其病理組織學(xué)打分(HBLS)均在4以上(圖5)。對照組法氏囊無明顯病理變化，其HBLS為1。

2.8拯救病毒對SPF雞的致死率rH4AGtB、rH4AH4B、rH4AHuB均能引起接種雞死亡，但每組死亡雞的數(shù)目及死亡時間不同。rH4AHuB接種雞第3d為死亡高峰期，5d后不再死亡，其對SPF雞的致死率高達(dá)80%。rH4AH4B接種雞死亡高峰期有所推遲，第4d為其死亡高峰期，其對SPF雞的致死率為73.3%。rH4AGtB接種雞死亡的數(shù)量明顯低于rH4AH4B和rH4AHuB，對SPF雞的致死率僅為33.3%。

3討論

IBDV早期研究認(rèn)為，B節(jié)段或其編碼的VP1蛋白與IBDV的毒力無關(guān)。Islam等認(rèn)為，具有多功能酶活性的VP1可以通過影響IBDV的復(fù)制，進(jìn)而影響病毒的毒力及致病性[11]。LeNouen等發(fā)現(xiàn)A節(jié)段源于強(qiáng)毒，而B節(jié)段源于非強(qiáng)毒的病毒比B節(jié)段源于強(qiáng)毒的病毒毒力要低。Liu等也證明了VP1蛋白與病毒的毒力有關(guān)。本研究將IBDVHLJ0504超強(qiáng)毒株的A節(jié)段分別與3個亞群B節(jié)段進(jìn)行組合，拯救了3種重組病毒rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB。接種雞法氏囊冰凍切片觀察，3種重組病毒在接種雞法氏囊內(nèi)呈包涵體形式。RT-PCR檢測結(jié)果表明，拯救病毒基因組序列中不存在任何點突變。體內(nèi)復(fù)制滴度檢測結(jié)果表明，rH4AH4B、rH4AHuB試驗組復(fù)制滴度高于rH4AGtB，但前者與rH4AGtB沒有明顯差異(p>0.05)，后者與rH4AGtB之間存在明顯差異(p<0.05)。這與之前研究結(jié)果一致，強(qiáng)毒來源的VP1對于病毒在體外的復(fù)制能力存在負(fù)效應(yīng)，對體內(nèi)的復(fù)制則存在正效應(yīng)。HuB-1株及HLJ0504株的B節(jié)段在遺傳進(jìn)化分析中分別處于第Ⅲ亞群和第Ⅱ亞群，這兩個亞群均為vvIBDV；Gt株的B節(jié)段則處于第Ⅰ亞群(non-vvIBDV亞群)，因此在具有相同A節(jié)段的情況下，包含第Ⅱ、Ⅲ亞群B節(jié)段的rH4AH4B、rH4AHuB體內(nèi)復(fù)制能力更強(qiáng)，而包含第Ⅰ亞群B節(jié)段的rH4AGtB體內(nèi)復(fù)制能力較弱。rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB對接種雞產(chǎn)生明顯的致病性。接種雞法氏囊嚴(yán)重萎縮；病理切片觀察，接種雞法氏囊有明顯的病理變化，多數(shù)濾泡內(nèi)淋巴細(xì)胞消失，其HBLS均在4以上；而且3種重組病毒均能引起接種雞的死亡，rH4AHuB引起雛雞死亡率為80%、rH4AH4B次之為73.3%、而rH4AGtB僅為33.3%。rH4AHuB接種雞第3d為死亡高峰期，5d后不再死亡，其對SPF雞的致死率高達(dá)80%。rH4AH4B接種雞死亡高峰期有所推遲，第4d為其死亡高峰期，其對SPF雞的致死率為73.3%。rH4AGtB接種雞死亡的數(shù)量明顯低于rH4AH4B和rH4AHuB，對SPF雞的致死率僅為33.3%。以上結(jié)果表明，IBDVB節(jié)段影響病毒的致病性，第Ⅱ、Ⅲ亞群的B節(jié)段使IBDV的致病性增強(qiáng)，而第Ⅰ亞群的B節(jié)段則使IBDV的致病性減弱。

該研究結(jié)果與之前研究一致，LeNouen等對一株自然分離毒株分析報道，該分離毒株的A節(jié)段來源于vvIBDV，B節(jié)段來源于非強(qiáng)毒株，結(jié)果表明與完全vvIBDV相比，該分離毒株對SPF雞的致病性大大降低。但與Boot等研究有所不同，Boot等拯救了一株其A節(jié)段來源于弱毒，而B節(jié)段來源于vvIBDV的重組病毒，研究表明該重組病毒不能引起接種雞的臨床癥狀，更不可能引起接種雞的死亡。綜上所述，IBDVB節(jié)段影響病毒的致病性，不同亞群B節(jié)段對IBDV致病性的影響作用不同。其中，第Ⅱ、Ⅲ亞群B節(jié)段能夠提高病毒在體內(nèi)的復(fù)制能力，從而使IBDV的致病性增強(qiáng)，而第Ⅰ亞群的B節(jié)段則降低了病毒在體內(nèi)的復(fù)制能力，使IBDV的致病性減弱。然而，不同亞群B節(jié)段影響病毒復(fù)制及致病性的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

作者：高立李凱祁小樂高玉龍高宏雷王永強(qiáng)孔憲剛王笑梅單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/禽免疫抑制病科技創(chuàng)新團(tuán)隊