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摘要:目的采用指紋圖譜與系統聚類分析方法評價不同產地旱田草的質量。方法采用PhenomenexC18色譜柱(250mm×4．60mm，5μm)，流動相為乙腈－0．2%磷酸水溶液，梯度洗脫，檢測波長334nm，柱溫30℃;建立旱田草藥材的HPLC指紋圖譜，對14批藥材進行相似度評價，并進行聚類分析。結果14批旱田草藥材HLPC指紋圖譜的精密度、重復性及穩定性的RSD均＜3%，指紋圖譜的相似度均＞0．96;14批旱田草總共可聚為5類。結論HPLC指紋圖譜與聚類分析相結合，數據穩定可靠，方法簡便高效，可為旱田草的質量評價提供參考。

關鍵詞:廣西;壯藥;旱田草;高效液相色譜法;相似度;指紋圖譜;聚類分析;質量評價

旱田草來源為參科植物旱田草Linderniaruellioides(Colsm．)Pennell．的干燥全草［1］，具有解毒、消腫、理氣、活血的功效，主治閉經、痛經、月經不調、乳癰等病癥。分布于中國西南地區，在廣西主要分布于南寧、柳州、融水、靈川、岑溪等地［2］，生于草地、平原、山谷、林下［3］，在兩廣一帶具有一定的使用歷史，為廣西民間常用壯藥之一。關于旱田草的研究較少，僅有顯微鑒別、生藥學、定性定量及質量標準等方面的研究［4－6］，未見其指紋圖譜研究。為了完善旱田草的質量控制，合理開發利用廣西本土藥材資源，現采用HPLC法建立旱田草的指紋圖譜，并進行聚類分析，為其質量控制提供實驗依據。

1實驗部分

1.1儀器與試藥1260高效液相色譜儀(美國Agilent)。14批旱田草，經蔡毅教授鑒定為玄參科植物旱田草Linderniaruellioides(Colsm．)Pennell．的全草，藥材干燥處理后，粉碎，統一過3號篩，備用;毛蕊花糖苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:111530－201310);甲醇、乙腈為色譜純;水為超純水;其余試劑為分析純。

1.2方法與結果1.2.1溶液的制備精密稱定0．3840mg毛蕊花糖苷對照品，用甲醇定容至1mL，得0．384mg•mL－1對照品溶液。精密稱定0．4g旱田草藥材粉末，加入25mL70%甲醇，稱重，超聲處理(功率250W、頻率40kHz)30min，放冷至25℃，用提取溶劑補足失重，定性濾紙濾過，取續濾液，于1．3×104r•min－1離心，即得供試品溶液。1.2.2色譜條件采用PhenomenexC18色譜柱(250mm×4．6mm，5μm)，流動相為乙腈(A)－0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～5min、5%～15%A，5～45min、15%～15．5%A，45～55min、15.5%～26．5%A，55～70min、26．5%～30%A，70～75min、30%～35%A)，檢測波長334nm，柱溫30℃，進樣量10μL。吸取10μL甲醇溶液進樣，在色譜條件下進行測定，結果空白溶液基線平穩，無雜質，無干擾。1.2.3精密度、重復性與穩定性試驗精密稱定0．4g8號藥材，按“1．2．1”項方法提取樣品，按“1.2.2”項色譜條件進樣測定，連續進樣6針。結果各峰RT的RSD為0．05%～0．19%，各峰RA的RSD為0．17%～1．88%，表示該實驗儀器的準確性良好。精密稱定8號實驗藥材粉末6份各0．4g，按“1．2．1”項方法制備樣品，按“1．2．2”項色譜條件進樣測定，記錄圖譜。結果6份旱田草中各峰RT的RSD為0．03%～0．46%，各峰RA的RSD為0.59%～2．36%，說明該實驗方法的數據可靠，重復性良好。精密稱定8號藥材粉末，按“1.2.1”項方法制備樣品，按“1．2．2”項色譜條件，于樣品制備后0、2、4、8、12、24、36h時進樣10μL，進行測定。計算得各峰相對保留時間的RSD為0．03%～0.74%，各峰相對峰面積的RSD為0．21%～2．71%，說明旱田草樣品溶液在36h內相對穩定。1.2.4指紋圖譜的匹配圖與相似度分析精密稱定14批的樣品粉末各0．4g，按“1．2．1”項方法制備樣品溶液，按“1．2．2”項色譜條件，進樣測定，采集圖譜，將14批旱田草的色譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版》軟件中，計算相似度，14批旱田草圖譜的相似度見表1，匹配圖見圖1。15個共有峰的匹配情況見表2(匹配數目均為14，保留時間的RSD均為相同)。1.2.5對照圖譜及共有峰采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版》軟件進行自動匹配，結果標定了15個共有峰，匹配數目為14。選擇8號圖譜為參照圖譜，采用中位數法，時間寬度為0．5min，建立旱田草的對照指紋圖譜(圖2)。峰面積＞5%的共有峰為:6號、7號、9號、11號、12號，其中12號峰為毛蕊花糖苷，標定為參照峰S，其余特征峰以1、2、3……N進行標定。以參照峰S的峰面積和保留時間作為1，計算共有峰的相對峰面積和相對保留時間。1.2.6系統聚類分析運用IBMSPSSStatistics19．0軟件對14批旱田草的實驗數據進行系統聚類分析，組間聯接法，Euclidean距離為度量標準。分析結果見圖3。

2討論

曾考察了不同色譜柱(InertsilODS－3、PhenomenexC18、Diamonsil)、流動相系統(甲醇－水、乙腈－水、甲醇－0．2%磷酸水、乙腈－0．2%磷酸水)、檢測波長(210、254、334、360nm)、提取方法(回流、超聲、冷浸)、提取溶劑(50%甲醇、50%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、甲醇、無水乙醇)、提取時間(90、60、30min)等分離結果的影響。結果表明:PhenomenexC18所得色譜圖峰信息量多，峰形較好;635華西藥學雜志第33卷；乙腈－0．2%磷酸水所得圖譜的基線平穩，分離度好，峰信息多且峰面積高;在334nm條件下，基線均較平穩，峰信息量多且峰形好;以超聲及回流提取所得樣品的色譜峰高和峰面積較冷浸提取高，考慮操作簡便，以超聲提取為佳;采用70%甲醇提取時，各色譜峰基線平穩，峰面積較高，分離度較好;顯示各特征峰的峰高和峰面積無明顯變化，從人力、物力方面考慮，選擇提取時間為30min為佳。14批旱田草藥材通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版》軟件進行相似度計算，相似度均＞0．96，符合指紋圖譜的要求，建立了旱田草指紋圖譜共有模式，標定了共有峰15個，匹配數目為14。14批藥材的聚類結果:S3、S9、S12均單獨為一類;S4、S7、S8、S11、S14聚為一類;S1、S2、S5、S6、S10、S13聚為一類，共5類。由于S3藥材所含毛蕊花糖苷的含量為14批次中最低，且共有峰峰面積均較小，原因可能是其被單獨分為一類;S9、S12與各產地均未有聚合，不同產地的藥材存在地域差異性，但S9、S12均于10月份采自來賓市，卻未聚為同一類，其可能原因是S9藥材已儲藏一年，導致多個共有峰A相差較大而被單獨各聚為一類;S4、S7、S8、S11、S14均來自桂平市，產地差異較小，相似度較高，被聚為同一類;S1、S6、S10、S13均采于河池大化，地域差異不大故聚為一類，S2、S5的3～11號共有峰面積之和/本產地總峰面積≈S1、S6、S10、S13的3～11號共有峰面積之和/本產地總峰面積，相差較小而與之聚為同一類;由于地理環境(土壤、光照、濕度等)或其他因素導致壯藥旱田草的含量及圖譜存在一定的差異性，有待研究。利用HPLC指紋圖譜結合各特征峰的含量變化來監測與控制藥材的質量是可取的，比單純測定藥材中某單一組分的含量更能全面客觀的反映藥材的內在質量。聚類分析法應用于藥材的鑒別、分類及中成藥成分分析。HPLC指紋圖譜與聚類分析相結合，數據穩定可靠，方法簡便高效，可為旱田草質量的品質評價、真偽鑒別及質量控制提供參考。

參考文獻:

［1］廣西區中醫藥研究所．廣西藥用植物名錄［M］．南寧:廣西人民出版社，1986:467－468．

［2］覃海寧，劉演．廣西植物名錄［M］．北京:科學出版社，2010:378－379．

［3］梁啟成，鐘鳴．中國壯藥學［M］．南寧:廣西民族出版社，2005:397．

［4］唐玉榮，顏萍花，曾祥燕，等．旱田草顯微鑒別研究［J］．時珍國醫國藥，2015，26(8):1938－1939．

［5］唐玉榮，顏萍花，曾祥燕，等．旱田草的生藥學研究［J］．華西藥學雜志，2016，31(4):386－388．

［6］曹雨虹，武尉杰，譚睿，等．HPLC測定母草屬藥用植物中的齊墩果酸和綠原酸［J］．華西藥學雜志，2015，30(4):514－516．

作者：謝鳳鳳 黎理 唐玉榮 曾祥燕 蔡毅 單位：廣西中醫藥大學