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《中華中醫(yī)藥雜志》2014年第七期

一、軟骨細胞凋亡調(diào)控軟骨退變的作用機制

細胞凋亡（細胞程序性死亡）是一個主動的、信號依賴的過程，并由基因控制的主動的、高度有序的死亡過程。在正常情況下，軟骨細胞也存在著凋亡的現(xiàn)象，軟骨細胞凋亡對維持關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。不同年齡組動物關(guān)節(jié)軟骨中細胞凋亡程度與年齡增長有關(guān)，軟骨細胞的凋亡在成熟關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)的維持、再建和更新過程中也發(fā)揮重要的調(diào)控作用。若軟骨細胞的凋亡超出一定的范圍，會導(dǎo)致軟骨細胞數(shù)量減少，軟骨細胞數(shù)量的變化不僅引起軟骨基質(zhì)合成與分泌的減少，而且還能引起維持軟骨基質(zhì)合成與降解酶系統(tǒng)平衡的紊亂，最終引起軟骨基質(zhì)的質(zhì)與量發(fā)生變化，軟骨基質(zhì)的這種變化又會促進軟骨細胞的凋亡，從而導(dǎo)致軟骨退變。目前研究表明，線粒體凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡、細胞自噬在OA的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

1.軟骨細胞線粒體凋亡信號通路與軟骨退變的關(guān)系軟骨退變是OA發(fā)生發(fā)展的一個重要因素，出現(xiàn)軟骨細胞數(shù)減少、抗氧化防御能力下降、生長因子和細胞因子免疫應(yīng)答改變及基因和蛋白表達模式改變等。促凋亡與抗凋亡信號之間的失衡是介導(dǎo)軟骨細胞凋亡的關(guān)鍵，各種因素引起的凋亡信號傳至軟骨細胞內(nèi)的作用位點，激活靶分子而產(chǎn)生酶級聯(lián)效應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡，線粒體凋亡通路是軟骨細胞凋亡的重要途徑之一。線粒體具有傳遞電子、氧化磷酸化、能量代謝、貯存Ca2+、抗活性氧化等重要生理作用。線粒體功能障礙時生成活性氧，過多的活性氧可引起線粒體損傷，從而釋放促凋亡因子，導(dǎo)致細胞凋亡?；钚匝蹩勺饔糜诰€粒體內(nèi)膜通透改變孔道（permeabilitytransitionpore，PTP），加速PTP開放，釋放細胞色素C（cytochromeC，CytoC）促進軟骨細胞凋亡，而釋放的CytoC又改變線粒體內(nèi)電子傳遞鏈的功能，引起活性氧生成增加。正常細胞中CytoC位于線粒體內(nèi)外膜之間，在電子呼吸傳遞鏈中起重要作用。當(dāng)在凋亡發(fā)生時，CytoC從線粒體釋放入胞質(zhì)，啟動半胱氨酸蛋白水解酶活化，與半胱氨酸蛋白酶-9前體、凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）形成凋亡小體，并在脫氧腺苷三磷酸（deoxy-adenosinetriphosphate，dATP）輔助下激活Caspase-9；Caspase-9激活Caspase-3，活化的Caspase-3瀑布式活化Caspase-2、6、8、10，而激活的Caspases最終活化脫氧核糖核酸酶（CAD/DFF45），水解核酸及細胞骨架，引起細胞凋亡[7-8]。Bcl-2通過抑制CytoC釋放，降低活性氧生成，從而抑制凋亡。Bax為編碼Bcl-2相關(guān)蛋白X的基因，具有誘導(dǎo)細胞凋亡的功能，Bcl-2/Bax之間的比例是調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵因素。p53位于線粒體上的轉(zhuǎn)錄因子，能上調(diào)促凋亡基因的表達，下調(diào)抗凋亡基因的表達。p53基因表達產(chǎn)物的聚集使Bax表達增加，進而釋放CytoC并激活Caspase，引發(fā)細胞凋亡。

2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)與軟骨退變的關(guān)系軟骨內(nèi)無血管和神經(jīng)支配，代謝主要通過滲透作用，對缺氧、鈣代謝紊亂、機械性壓力、自由基侵襲等應(yīng)激因素很敏感，易發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在膜蛋白的合成、修飾和折疊及維持細胞內(nèi)鈣Ca2+的穩(wěn)定等方面都發(fā)揮關(guān)鍵性作用。當(dāng)機體細胞受到缺氧、饑餓、自由基侵襲及鈣代謝紊亂等應(yīng)激因素刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白增多或鈣失衡，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受蛋白（PEAK、ATF-6和IRE-1）介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不僅是糾正內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂的重要機制，在強烈、持久應(yīng)激刺激時，內(nèi)環(huán)境紊亂無法糾正，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受蛋白則會啟動凋亡程序，誘發(fā)細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細胞凋亡異于其他凋亡路徑，有其自身的信號通路，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡途徑，此途徑包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)CHOP/GADD153表達、C-JUN氨基末端激酶（JNK）活化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的Capase-12蛋白水解酶活化。CHOP/GADD153是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的轉(zhuǎn)錄因子，PEAK、ATF-6和IRE-1的活化均能促進CHOP的大量產(chǎn)生。CHOP表達增加會下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達，促進反應(yīng)性氧中介物（ROIs）和減少細胞內(nèi)谷胱甘肽生成，從而引發(fā)細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，活化的IRE1招募JNK和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子TRAF2，TRAF2激活細胞凋亡信號激酶1（ASK1），并形成IRE-1/TRAF2/ASK1三聚體，隨后激活JNK，誘導(dǎo)細胞凋亡。Caspase-12位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+平衡的破壞或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白的過量積聚均會誘導(dǎo)Caspase-12表達，同時也導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)Caspase-7轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，Caspase-7激活Caspase-12，激活的Caspase-12可進一步活化Caspase-3，引發(fā)細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Bcl-2家族中抑凋亡蛋白則可調(diào)節(jié)網(wǎng)腔中游離Ca2+濃度，維持胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度在合適的水平，進而抑制細胞凋亡[14-15]。

3.細胞自噬與軟骨退變的關(guān)系細胞自噬（autophagy）是依賴溶酶體途徑對胞質(zhì)蛋白和細胞器進行降解的一種過程，并利用降解產(chǎn)物提供能量和重建細胞結(jié)構(gòu)，在維持細胞穩(wěn)態(tài)和細胞生命活動等方面起重要作用。細胞自噬與凋亡間的關(guān)系較為復(fù)雜，目前研究表明，自噬標(biāo)志性基因ULK、Beclin1、LC3在正常的關(guān)節(jié)軟骨中有明顯表達，退變軟骨中自噬水平下降（其機制與溶酶體水解失敗密切相關(guān)），導(dǎo)致退變軟骨中自噬體清除減緩和毒性蛋白增加。自噬在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡中更傾向于保護軟骨細胞，當(dāng)細胞器受損時，細胞內(nèi)自噬水平明顯升高，以清除受損的細胞器，阻止細胞凋亡啟動，但自噬過度或不足均可能導(dǎo)致自噬性細胞死亡[17-18]。因此，細胞自噬一方面保護細胞，另一方面則可導(dǎo)致自噬性細胞死亡。Atg1、Atg6、Atg8（哺乳動物中的同源物分別稱作ULK1、Beclin1、LC3）是自噬途徑的3個主要管理者，分別充當(dāng)誘導(dǎo)者、調(diào)節(jié)者、執(zhí)行者的角色。在哺乳動物中，mTOR整合生長因子、營養(yǎng)分子、氨基酸和能量感受信號，調(diào)控細胞生長、增殖、營養(yǎng)運輸、蛋白合成和自噬。細胞內(nèi)營養(yǎng)缺乏時，mTOR活性受抑制，導(dǎo)致Atg家族成員激活，從而促進自噬泡形成；細胞內(nèi)營養(yǎng)充足時，mTOR激活，從而抑制細胞自噬的發(fā)生。死亡相關(guān)蛋白激酶（DAPK）也是細胞自噬的重要調(diào)節(jié)因子，可使微管相關(guān)蛋白（MAP）1B磷酸化，進而使MAP1輕鏈3（LC3）-Ⅱ與自噬體膜結(jié)合。自噬蛋白Beclin1的BH3結(jié)構(gòu)域與DAPK相互作用，可使BH3結(jié)構(gòu)域磷酸化，從而阻斷Beclin1與凋亡基因Bcl-2和凋亡抑制基因Bcl-xL相互作用，促進自噬發(fā)生。

二、獨活寄生湯干預(yù)軟骨細胞凋亡的機制

軟骨細胞凋亡原因是多方面的，但最終都離不開凋亡相關(guān)因子的參與和調(diào)節(jié)。肝腎虧虛證存在不同程度的下丘腦-垂體-靶腺（腎上腺、甲狀腺、性腺及胸腺）軸功能紊亂，影響機體的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)功能，從而產(chǎn)生一系列的臨床癥狀及體征。補腎柔肝藥能多方位調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-靶腺軸及神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的功能，調(diào)節(jié)異常的細胞因子水平，上調(diào)性激素水平，保護軟骨細胞，調(diào)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解，參與調(diào)控軟骨退變；補腎柔肝、祛風(fēng)活血藥通過影響凋亡信號通路，抑制促凋亡基因并促進抗凋亡基因的表達，從而抑制軟骨細胞凋亡和促進增殖。因此，獨活寄生湯作用機制可能是通過調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)、神經(jīng)-內(nèi)分泌-骨代謝系統(tǒng)的功能，調(diào)節(jié)線粒體功能、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、細胞自噬水平是獨活寄生湯干預(yù)軟骨細胞凋亡的重要作用途徑。

作者：劉發(fā)元李西海葉蕻芝劉獻祥單位：福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院