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【摘要】

目的探討Notch2和MEK／ERK信號(hào)通路在胃癌細(xì)胞SGC－7901中是否存在交叉作用。方法采用體外化學(xué)合成的特異性針對(duì)Notch2的siRNA（Notch2siRNA）和絲裂原激活蛋白激酶（MEK）／細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路的抑制劑PD98059，分別單獨(dú)和聯(lián)合處理體外培養(yǎng)的胃癌SGC－7901細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA（controlsiRNA）細(xì)胞作為siRNA對(duì)照組，并設(shè)不給予任何轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組。免疫印跡（WesternBlotting）法檢測(cè)磷酸化ERK1／2（p－ERK）1／2和Notch2蛋白的表達(dá)水平。比色法（MTT）檢測(cè)癌細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果Notch2siRNA能降低蛋白Notch2的表達(dá)水平，并抑制癌細(xì)胞增殖［（38．26±1．82）％］，而p－ERK的表達(dá)水平則較對(duì)照組增加。PD98059能降低p－ERK的表達(dá)水平，并抑制癌細(xì)胞的增殖［（30．05±3．16）％］，Notch2水平則無明顯變化，聯(lián)合應(yīng)用Notch2siRNA和PD98059能明顯降低p－ERK和Notch2蛋白的表達(dá)水平，與Notch2siRNA或PD98059單獨(dú)應(yīng)用比較，顯著抑制癌細(xì)胞增殖率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（72．55±5．30）％，P＜0．01］。結(jié)論特異性抑制Notch2信號(hào)通路，且抑制MEK／ERK通路可進(jìn)一步增強(qiáng)抑制Notch2通路的抗腫瘤增殖效果，提示MEK／ERK和Notch22條信號(hào)通路在胃癌SGC－7901細(xì)胞中存在交叉作用。

【關(guān)鍵詞】

Notch2；MEK／ERK；抑制劑；信號(hào)通路；交叉作用

胃癌在我國乃至世界范圍內(nèi)均為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與病死率在我國有上升趨勢(shì)［1］。目前，我國胃癌的整體診治水平仍不高，針對(duì)腫瘤細(xì)胞生長、凋亡等分子生物靶點(diǎn)提出的分子靶向治療逐漸成為胃癌綜合治療的重點(diǎn)和熱點(diǎn)［2］。有研究表明，Notch信號(hào)通路的活性紊亂與多種腫瘤（如胃癌）的形成有關(guān)，阻滯Notch信號(hào)通路將有望成為腫瘤治療的新策略［3－4］。Notch基因通過編碼跨膜受體而誘發(fā)多級(jí)生物級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而參與如細(xì)胞增殖、凋亡、周期轉(zhuǎn)變、分化、血管生成、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞遷移、上皮細(xì)胞－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等細(xì)胞生物學(xué)過程［3－5］。絲裂原激活蛋白激酶（MEK）／細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）在多種癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，ERK的活化位于MEK超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的下游，主要負(fù)責(zé)由MEK始動(dòng)的生物信息轉(zhuǎn)導(dǎo)，處于這一通路的中心環(huán)節(jié)［6］。有研究發(fā)現(xiàn)Notch和ERK通路存在相互作用，共同參與細(xì)胞分子生物學(xué)行為［7］。本實(shí)驗(yàn)通過單獨(dú)或聯(lián)合阻滯這2個(gè)信號(hào)通路，探討其在胃癌細(xì)胞系SGC－7901中的作用及影響。報(bào)道如下。

1材料與方法

1．1一般材料（1）細(xì)胞：胃癌SGC－7901細(xì)胞系由臺(tái)州學(xué)院腫瘤研究所細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室傳代保存。（2）試劑：RPMI－1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO生物技術(shù)公司；ERK1／2抗體、磷酸化ERK1／2抗體、Notch2抗體、GAPDH抗體及相關(guān)二抗試劑盒均購自美國的CST公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、PD98059和二甲基亞砜（DMSO）購自美國的Sigma公司；Notch2siR－NA及陰性對(duì)照siRNA（ControlsiRNA）購自美國的SantaCruz公司；提取總蛋白試劑盒及WesternBlotting所需的其他試劑來源于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1．2方法

1．2．1細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA轉(zhuǎn)染胃癌SGC－7901細(xì)胞置入含10％小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中。6％CO2濃度、37℃培養(yǎng)。1×107／L細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板（MTT使用96孔板，其他實(shí)驗(yàn)采用6孔板）。根據(jù)說明書建議，將siRNA濃度稀釋為50nmol／L，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染siRNA。siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分為3組，Notch2siRNA干預(yù)組、陰性對(duì)照siRNA組、空白對(duì)照組。

1．2．2比色法（MTT）檢測(cè)細(xì)胞增殖采用含10％胎小牛血清的培養(yǎng)液將貼壁細(xì)胞配成單個(gè)細(xì)胞懸液，濃度為10000～20000／mL，每孔體積200μL細(xì)胞接種到96孔板，細(xì)胞貼壁后即加處理因素，每種處理設(shè)5個(gè)復(fù)孔。使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定490nm處的吸光度（A值），按照公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（CI）／％＝1－（處理組平均A值／空白組平均A值）×100％，并繪制直方圖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1．2．3免疫印跡法（WesternBlotting）檢測(cè)收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，將樣品置于100g／L不連續(xù)SDS聚丙烯酰胺凝膠加樣孔中，初始電壓為80V，當(dāng)溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后，電壓提高至120V，繼續(xù)電泳直至分離膠底部。電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉，與Notch2抗體、ERK1／2抗體或磷酸化的ERK1／2抗體4℃孵育，過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫?fù)u晃1h，顯色，放射自顯影。顯影信號(hào)的強(qiáng)弱用密度分析值反映ERK1／2、磷酸化的ERK1／2、Notch2水平（以GAPDH蛋白為內(nèi)參對(duì)照）。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS18．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料組間比較使用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較應(yīng)用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1胃癌SGC－7901細(xì)胞的Notch2阻滯導(dǎo)致ERK1／2活化使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將Notch2siRNA載體瞬間轉(zhuǎn)染人胃癌SGC－7901細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后WesternBlot驗(yàn)證Notch2siRNA干擾SGC－7901細(xì)胞中活化的Notch2蛋白（ICN2）表達(dá)，活化的Notch2表達(dá)顯著下調(diào)，即出現(xiàn)Notch2通路阻滯，并伴隨磷酸化的ERK1／2表達(dá)增加，致使ERK1／2活化，提示ERK1／2活化與Notch2下調(diào)有關(guān)。見圖1。

2．2聯(lián)合應(yīng)用Notch2siRNA和PD98059對(duì)Notch2和p－ERK1／2的表達(dá)水平的影響Notch2siRNA轉(zhuǎn)染能顯著降低蛋白Notch2的表達(dá)水平，而p－ERK1／2的表達(dá)水平則較對(duì)照組增加；MEK／ERK通路的抑制劑PD98059能降低p－ERK1／2的表達(dá)水平，Notch2水平則無明顯變化；Notch2siRNA和PD98059聯(lián)合應(yīng)用后，p－ERK1／2和Notch2蛋白的表達(dá)水平均降低。見圖2。

2．3Notch2siRNA和PD98059聯(lián)合應(yīng)用對(duì)SGC－7901細(xì)胞增殖的影響Notch2siRNA和PD98059均能抑制胃癌SGC－7901細(xì)胞增殖，其細(xì)胞增殖抑制率分別為（38．26±1．82）％和（30．05±3．16）％，且Notch2siRNA和PD98059聯(lián)合應(yīng)用癌細(xì)胞的增殖率降低更明顯，其細(xì)胞增殖抑制率為（72．55±5．30）％，顯著高于Notch2siRNA和PD98059單獨(dú)處理，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。見圖3。

3討論

Notch通路家族包括4個(gè)受體（Notch－1、2、3、4）和5種配體（jagged－1，jagged－2，Delta樣受體1、3、4）［3－5，8］。細(xì)胞Notch受體與鄰近細(xì)胞Notch配體結(jié)合后，Notch通路即被激活［8］。激活的Notch蛋白在金屬蛋白酶腫瘤壞死因子－α轉(zhuǎn)化酶（TA－CE）和γ－分泌酶復(fù)合物（γ－secretasecomplex）的蛋白水解下，釋放其細(xì)胞內(nèi)部分ICN，當(dāng)ICN進(jìn)入細(xì)胞核后活化Notch－CSL復(fù)合物，則進(jìn)一步調(diào)控多個(gè)下游靶基因的表達(dá)［9］。如果采用特異性針對(duì)Notch2的siRNA下調(diào)Notch2表達(dá)則能阻斷上述過程。

MEK／ERK通路在多種癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，ERK的活化位于MEK超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的下游，主要負(fù)責(zé)由MEK始動(dòng)的生物信息轉(zhuǎn)導(dǎo)，處于這一通路的中心環(huán)節(jié)。使用特異性抑制劑降低其下游磷酸化ERK的水平，從而阻斷ERK的磷酸化活化及其下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而阻斷MEK通路的生物學(xué)效應(yīng)［10］。本組的前期工作發(fā)現(xiàn)，非選擇性Notch通路阻滯劑DAPT（一種γ分泌酶抑制劑）未能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞明顯凋亡，卻激活ERK1／2通路［11］。當(dāng)然，DAPT對(duì)Notch通路家族（Notch1～4）均可能有阻滯作用，具體是哪個(gè)Notch通路家族成員的阻滯而導(dǎo)致ERK1／2活化，以及ERK1／2活化對(duì)該Notch通路阻滯的抗腫瘤作用的影響及機(jī)制尚不清楚。由于維持癌細(xì)胞生存的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是由一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)完成，對(duì)癌細(xì)胞某單一生存信號(hào)通路的阻滯常導(dǎo)致其他的生存信號(hào)通路的激活，從而使癌細(xì)胞有可能逃脫針對(duì)單一通路的治療作用［12］。

本研究結(jié)果表明，Notch2siRNA能抑制癌細(xì)胞的增殖，降低蛋白Notch2的表達(dá)水平，而Notch2siRNA也能增加p－ERK1／2的表達(dá)水平。PD98059能降低p－ERK1／2的表達(dá)水平，并抑制癌細(xì)胞的增殖，但對(duì)Notch2表達(dá)水平則無明顯變化。與單獨(dú)使用Notch2siRNA或PD98059比較，聯(lián)合使用Notch2siRNA和PD98059阻滯這2種信號(hào)通路后，能更顯著地降低p－ERK1／2和Notch2蛋白的表達(dá)水及胃癌細(xì)胞的增殖率。提示Notch2信號(hào)通路被抑制后ERK1／2通路活性被某種程度地上調(diào)，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用MEK／ERK通路抑制劑PD98059，從而抑制ERK1／2通路，使得2條通路均被抑制，則胃癌細(xì)胞的增殖抑制率更明顯。由此本組設(shè)想，Notch2通路的阻滯可能會(huì)導(dǎo)致胃癌細(xì)胞中其他生存信號(hào)通路（如ERK1／2通路）的活化，從而使胃癌細(xì)胞有可能逃脫針對(duì)Notch2通路的靶向治療作用。然而，該作用在不同分化程度的胃癌細(xì)胞中是否具有普遍性，以及Notch2阻滯誘導(dǎo)的ERK1／2活化對(duì)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的具體作用及其機(jī)制，則有待于通過本項(xiàng)目的深入研究。

作者：劉富強(qiáng) 陳依依 岳婷婷 葉蓓 錢翠娟 姚軍 單位：臺(tái)州學(xué)院椒江校區(qū)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)教研室 浙江省臺(tái)州市立醫(yī)院消化內(nèi)科