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【摘要】

目的現行方法建立的乳腺癌動物模型多用于觀察其生物學表現，不適于探索新的淋巴結轉移治療方案。本研究通過改良制作方法建立新型的乳腺癌淋巴結轉移模型，為探索新的治療方法提供實驗動物模型。材料與方法采用組織塊包埋法將VX2傳代瘤株種植于30只雌性兔左側第3只乳頭的乳墊內，每周采用觸診法和常規超聲查看腫瘤及淋巴結生長情況。待觸及腫大的淋巴結后切除乳腺癌組織。第4周隨機摘取15枚淋巴結，采用病理學觀察淋巴結形態及組織學改變。將游標卡尺與超聲測量結果進行對照，比較其差異。結果2周后，26只實驗兔可觸及乳腺內質韌的類圓形結節；超聲呈低回聲，邊界欠清，內部及周邊血流豐富。約3周后，23只實驗兔的左側腋窩處可觸及腫大的淋巴結，病理證實為轉移性淋巴結，淋巴結轉移率為88.5%，造模成功率為76.7%。超聲與病理兩種方法測量淋巴結最大直徑差異無統計學意義（P>0.05）。結論改良法建立乳腺癌淋巴結轉移模型周期短、成功率高、方法簡單，能夠為研究新療法提供動物模型；常規超聲能夠實時監測腫瘤的生長狀況，操作方便、快捷。

【關鍵詞】

乳腺腫瘤；淋巴轉移；超聲檢查,乳房；病理學，外科；疾病模型，動物；兔

女性癌癥患者中乳腺癌發病率最高，30~59歲女性為乳腺癌高發人群，乳腺癌也是45歲以下女性最常見的癌癥死因[1]，其中腫瘤淋巴轉移是導致治療失敗造成患者死亡的主要原因。目前針對術后淋巴結復發轉移的治療方法主要有化療、放射治療、永久性粒子植入[2]及實驗階段的淋巴靶向藥物治療[3]，盡管治療方法很多，但乳腺癌病死率依然很高，所以仍需探索新的治療方法、開發新的藥物來提高乳腺癌患者的生存率和改善預后。目前建立專門用于乳腺癌晚期治療研究的大型實驗動物模型報道較少，VX2組織塊包埋法建立的兔乳腺癌淋巴結轉移模型具有成瘤周期短、成功率高等優點。本實驗主要探討改良型乳腺癌淋巴結轉移模型建立方法的可行性。

1材料與方法

1.1實驗材料

8月齡普通級雌性新西蘭大白兔30只，體重2.5~3.0kg，購自山東省農科院（許可證號SCXK20090013）。西門子乳腺容積成像系統，型號ACUSONS2000，探頭為9L4，頻率5~8MHz。

1.2兔VX2細胞株的制備

8月齡健康雌性經產新西蘭大白兔30只，體重2.5~3.0kg；雄性兔1只，體重2.2kg，建荷瘤兔用于取材。用固定器將待接種的新西蘭大白兔固定，鹽酸利多卡因0.5ml以0.1ml/s緩慢局部注射至左下肢內側（已備皮）肌肉豐富區。用無菌一次性手術刀在注射部位切開約1.0cm開口，鈍性分離皮下筋膜及肌肉，肌肉分離深度約0.5cm。將液氮中凍存的VX2腫瘤組織37℃解凍復蘇后，裁剪成大小約1.2mm×1.2mm×1.2mm的組織塊接種到切口中[4]，逐層縫合。

1.3乳腺癌淋巴結轉移模型的建立

3周后，無菌條件下將瘤組織取出（直徑約1.5cm），取周邊生長旺盛的魚肉樣組織，放入玻璃皿中，內盛滴加有慶大霉素的生理鹽水（50ml生理鹽水含慶大霉素2萬U），反復清洗并剔除瘤組織表面的血液和結締組織。在另一培養皿中用眼科剪將組織塊裁剪成1.0mm3大小的瘤組織塊備用。將實驗兔仰臥位固定于兔臺上，胸部剃毛，按外科無菌程序消毒術區皮膚，鋪無菌洞巾。在其左側胸壁第3乳頭處局部注射利多卡因，輕柔片刻，用手術刀在距乳頭1cm的外上象限處作弧形切口，長度約1cm，鈍性分離筋膜暴露乳墊，用眼科鑷子向乳腺實質中央斜插約0.5cm深，并撐開少許，做成一直徑約2.0mm的竇道，拔出鑷子壓迫止血，取備用的1塊腫瘤組織植入竇道底部。用直徑約3mm的明膠海綿填塞竇道入口處并輕壓至徹底止血后逐層縫合腹壁。手術當天切口處撒青霉素，術后3d肌肉注射青霉素20萬U/（kg·d）預防感染。

1.4病理學檢查

每周采用直接觸診和超聲檢查腫瘤的生長情況，并記錄腫瘤最大直徑，用超聲觀察腫瘤內部血流特點。待直接觸診能觸及質硬的淋巴結后行外科切除種植的乳腺癌組織，保留乳頭。第4周超聲檢查完畢后隨機取出15枚淋巴結做常規病理，用10%甲醛溶液固定，常規脫水、包埋和HE染色。1.5統計學方法采用SPSS20.0軟件，淋巴結最大直徑比較采用配對資料t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1模型成功率

30只兔造模，2周后26只成功長出乳腺移植瘤，造模成功率為86.7%；3周后23只發生淋巴結轉移，轉移率為88.5%（23/26），造模成功率為76.7%（23/30）。種植于乳腺的瘤組織1周即可用觸診法觸及，質韌，活動度差，呈類圓形。3、4周即可觸及質地較硬的轉移淋巴結。

2.2常規超聲

3周后超聲可見乳頭下類圓形的低回聲實性暗區，邊界尚清（圖1A），大小見表1；彩色多普勒血流顯像（CDFI）示腫瘤周邊和內部可見豐富的血流（圖1B），血流速度較低。4周后可見腫大的轉移性淋巴結內明顯的低回聲暗區，邊界清楚（圖1C），大小見表1；CDFI示淋巴結周邊和（或）內部血流信號豐富（圖1D）。阻力指數為0.35±0.05。

2.3病理學檢查結果

轉移性淋巴結肉眼可見表面凸凹不平，表面大量的微血管生成（圖2A），形態不規則，淋巴結門消失，大小（8.1±1.1）mm；縱行切開其內可見腫瘤轉移灶，呈魚肉樣，邊界不清；高倍鏡下可見腫瘤細胞體積大，核異型性明顯，呈多核，核漿比明顯增大（圖2B）。采用超聲與病理兩種方法測量的淋巴結最大直徑差異無統計學意義（t=0.617，P>0.05）。

3討論

乳腺癌模型的建立方法有自發性乳腺癌動物模型、誘發性乳腺癌動物模型和移植性動物模型。隨著科技的進步，基因敲除、基因打靶等技術為基因工程型[5]乳腺癌動物模型提供了技術保障，腫瘤基因模型也應運而生。盡管這些方法建立的動物模型均能引起淋巴結轉移，但是自發性乳腺癌動物模型建立周期長，且腫瘤發生步調不一致；誘導性動物模型腫瘤形態各異，差異較大，惡性程度低，因此這兩種方法在治療方法和抗腫瘤藥物的實驗研究方面應用尚不廣泛。盡管轉基因法成功地建立了MMVT-Wnt-1轉基因小鼠乳腺癌動物模型，但其體積小，對于創傷性大的外科手術耐受性差、條件要求高，帶瘤生長周期短，不適合用于治療方法的探索。移植性乳腺癌動物模型是用乳腺癌組織或細胞以至于實驗動物培養出來的模型[6]，移植方法包括腫瘤組織接種、組織塊懸液接種、細胞懸液注射等[7]。細胞懸液注射法過程復雜，影響實驗因素多，且轉移率不高，高薇[8]將細胞懸液注射到裸鼠皮下，乳腺癌建模成功率為100%，但是無淋巴結轉移。凌瑞等[9]應用新西蘭大白兔作為實驗動物建立乳腺癌模型，具有較高的轉移率（91.3%）。本實驗研究以上述學者的實驗方法為基礎并進一步改良，使之成為適合實驗研究的乳腺癌腋窩淋巴結轉移模型制作方法。傳統的組織塊接種法是將瘤組織種植于乳墊內，后續對原位移植瘤未進行處理，此法建立的乳腺癌模型不適用于復發性淋巴結轉移治療方法的研究。改良法建立兔乳腺癌淋巴結模型是先將VX2組織塊接種于左側第3乳墊內，發生淋巴結轉移以后再將原位種植的VX2移植瘤進行外科切除，此法的優勢為：①種植成活率高，生物學性質穩定，生長迅速。近年來，國內外大量研究將VX2瘤株種植于肝、腎、肌肉、骨、膀胱、子宮、肺等部位，建立相應的原位腫瘤動物模型[10-11]。②瘤塊包埋法建模簡便易行、創傷小，原位成瘤率高，異位接種少。③建立方法改良后更接近于人類乳腺癌術后的情況。④排除了實驗中非實驗因素的影響。如果不切除原位腫瘤而在實驗過程中發生了其他區域淋巴結轉移，則不能判斷在治療淋巴結轉移方面是否為失敗；凌瑞等[9]研究兔VX2乳腺癌模型4周后出現液化壞死，如果伴發感染后動物死亡則不易確定死亡原因。⑤淋巴結轉移率高[10,12]，本實驗中實驗兔均發生腋窩淋巴結轉移，與徐磊[13]的研究結果相似，腋窩淋巴結轉移率高。采用超聲檢測腫瘤生長操作簡單、省時，只需簡單掌握超聲操作方法即可。本實驗采用VX2腫瘤組織塊包埋法建立兔乳腺癌淋巴結轉移模型，符合理想動物腫瘤轉移模型應具備的特點：①模擬了人類腫瘤轉移途徑，即有原發灶的逃逸過程。人類乳腺癌最主要的轉移途徑為淋巴道轉移，該實驗的腋窩淋巴結轉移率為88.5%，低于凌瑞等[9]報道的91.3%，其可能原因為實驗條件、瘤組織活性及實驗動物本身的差異所致。②造模方法簡單、易于接受，而且腫瘤生長應一致，可重復性建模，成瘤周期短，原位腫瘤成瘤期為2周，淋巴轉移發生在3~4周。③腫瘤的病理生理特點與人類的腫瘤一致。④建模過程中動物死亡率低、損傷小，本實驗無動物意外死亡。⑤實驗過程中對環境污染及人體危害小。

4結語

總之，改良法建立動物模型成瘤周期短、方法簡單易操作、轉移率高，能夠用于人類乳腺癌淋巴結轉移治療方面的實驗研究。超聲法探查和檢測移植瘤的生長及特點操作簡便、準確、快捷。

參考文獻

[1]嵇健.磁性多壁碳納米管載負阿霉素對乳腺癌淋巴結轉移的治療作用的實驗研究.廣州:南方醫科大學,2014.

[2]魏強,雷振,馮國全,等.兔門靜脈種植VX2癌栓CT灌注參數與血管內皮生長因子的相關性.中國醫學影像學雜志,2014,22(9):650-654.

[3]王甲甲,李官成.基因工程雙價抗體在腫瘤中的研究進展.國際病理科學與臨床雜志,2008,28(6):508-511.

[4]宋獻美,方芳,馬吉春,等.利用小鼠皮下人乳腺癌移植瘤模型觀察MUC1-MBP抗乳腺癌作用.免疫學雜志,2010,26(5):428-432.

[5]潘秀華,馮玉梅.乳腺癌移植轉移模型的建立與應用.中國腫瘤臨床,2008,35(4):234-237,239.

[6]高薇.乳腺癌淋巴轉移動物模型的建立與評價.銀川:寧夏醫科大學,2014.

[7]凌瑞,陳江浩,姚青,等.兔轉移性乳腺癌模型:腫瘤生長及轉移.中國癌癥雜志,2005,15(1):9-11.

[8]楊文,王建,丁運萍,等.兔VX2腫瘤淋巴轉移動物模型建立和病理學觀察.四川動物,2010,29(4):633-635.

[9]徐磊.乳腺癌腋窩淋巴結轉移規律的臨床研究.濟南:山東大學,2008.

作者：劉峰 單位：濰坊醫學院醫學影像學系濰坊醫學院心理學系