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【摘要】目的:篩選肝癌合并糖尿病的診斷分子標(biāo)志，檢測(cè)其在肝癌及糖尿病中的表達(dá)情況，為早期診斷肝癌合并糖尿病提供相應(yīng)的分子標(biāo)志物。方法:通過(guò)綜合分析GEO及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選肝癌合并糖尿病的差異性分子，組織芯片上檢測(cè)其在正常組織及肝癌組織的表達(dá)情況，ELISA檢測(cè)其在糖尿病患者血清樣品中的表達(dá)情況。收集臨床血液標(biāo)本，檢測(cè)其在正常人、肝癌合并糖尿病、肝癌未合并糖尿病患者中的表達(dá)水平。繼而在15例肝癌患者中，分析上述分子標(biāo)志與血糖的相關(guān)性。結(jié)果:通過(guò)GEO及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到肝癌合并糖尿病的差異性基因CXCL14，組織芯片及ELISA結(jié)果表明CXCL14在肝癌患者及糖尿病患者中呈低表達(dá)。血液中CXCL14在肝癌合并糖尿病患者的表達(dá)水平明顯低于肝癌未合并糖尿病組。肝癌患者中CX-CL14表達(dá)水平與血糖濃度呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論:CXCL14可能與肝癌合并糖尿病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，早期檢測(cè)肝癌患者血清中CXCL14的表達(dá)水平可能作為糖尿病的一個(gè)預(yù)測(cè)指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】肝癌;糖尿病;CXCL14

WHO統(tǒng)計(jì)表明，肝癌在惡性腫瘤發(fā)病及死亡原因中排列第三位，每年超過(guò)80萬(wàn)人死亡［1，2］，肝癌仍然是一個(gè)日益嚴(yán)重的全球健康問(wèn)題。在中國(guó)，肝癌死亡率排列第二位，5年生存率僅為10．1%［3］。肝臟是維持血糖恒定的關(guān)鍵器官，肝糖原是血糖的重要來(lái)源。胃腸道吸收的糖30%～60%經(jīng)肝臟處理并轉(zhuǎn)化為糖原或氨基酸、脂肪酸，同時(shí)肝臟也是胰島素作用的一個(gè)重要靶器官［4］。肝功能受損，可影響糖代謝而出現(xiàn)血糖的波動(dòng)。肝臟的重要生理作用將肝病和糖尿病緊密聯(lián)系在一起。相關(guān)研究顯示，腫瘤患者中合并糖尿病的比率明顯高于普通人群中合并糖尿病的比率［5，6］。16890例臨床腫瘤患者在初次診斷時(shí)患糖尿病，胰腺癌、腎癌、結(jié)直腸癌、肝癌患者中糖尿病患病率較高，依次為18．76%、16．76%、12．34%、10．71%，并且腫瘤分期較晚。合并糖尿病的腫瘤患者總體死亡率明顯高于未合并糖尿病患者，其中位生存時(shí)間，3年生存率均明顯低于未合并糖尿病患者［7］。所以尋找相關(guān)分子標(biāo)志物早期預(yù)測(cè)肝癌合并糖尿病，具有重要的臨床意義。近年來(lái)，隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)方法的大量普及，國(guó)外已建立多個(gè)腫瘤臨床標(biāo)本資料、基因表達(dá)、基因突變等數(shù)據(jù)庫(kù)，如GEO，TCGA等［8，9］。R語(yǔ)言為開(kāi)放的編程平臺(tái)，為海量數(shù)據(jù)的提取、統(tǒng)計(jì)分析及數(shù)據(jù)的可視化等提供了可能［10］。以上數(shù)據(jù)庫(kù)含有豐富的臨床標(biāo)本及完備的臨床資料，為我們研究腫瘤相關(guān)分子標(biāo)志物奠定了充分的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1材料和方法

1．1材料

肝癌組織芯片微陣列(XT16－011)購(gòu)買自上海芯超生物科技有限公司。CXCL14抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。人胸腎表達(dá)趨化因子(BRAK/CXCL14)ELISA試劑盒(EME－H6609)購(gòu)買自KITZOME(中國(guó)深圳)。免疫組化試劑盒購(gòu)買自碧云天生物技術(shù)有限公司(中國(guó)上海)。

1．2差異基因的篩選

從GEO及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得測(cè)序數(shù)據(jù)并檢索相關(guān)的研究。數(shù)據(jù)集搜索僅限于英語(yǔ)，并在2016年11月結(jié)束。使用網(wǎng)格術(shù)語(yǔ)和自由詞增加搜索的敏感性。搜索詞包括“正常”;“糖尿病”;“肝癌”;“組織”;“腫瘤”或“瘤”或“癌癥”或“癌”。下載包含正常肝組織和肝癌組織的三個(gè)GEO數(shù)據(jù)集(GSE46408，GSE60502，GSE46444)。通過(guò)Perl語(yǔ)言集成“系列矩陣文件”及其相應(yīng)的平臺(tái)文件，創(chuàng)建一個(gè)包含基因標(biāo)志及其在每個(gè)樣本中的相應(yīng)表達(dá)的新文件。隨后通過(guò)limma文庫(kù)的R語(yǔ)言分析正常組和肝癌組中的差異基因。從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載TCGA－LIHC項(xiàng)目文件，包括374例肝癌組織和50例正常肝組織。通過(guò)Perl語(yǔ)言集成“轉(zhuǎn)錄組分析”;“基因表達(dá)定量”;“RNA測(cè)序”;“HT測(cè)序－計(jì)數(shù)”以創(chuàng)建一個(gè)新文件，包含基因標(biāo)志及其在每個(gè)樣本中的相應(yīng)表達(dá)。隨后通過(guò)edgeR文庫(kù)的R語(yǔ)言分析正常組和肝癌組中的差異基因。通過(guò)維恩圖展示GEO及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中分析得到的常見(jiàn)差異性基因。

1．3免疫組化染色

CXCL14抗體(1∶200)用于免疫組化檢測(cè)組織中CX-CL14的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)步驟詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)［11］。使用Olym-pusBX51顯微鏡獲得所有圖像。使用半定量評(píng)分方法評(píng)價(jià)免疫組化染色，兩名病理學(xué)家獨(dú)立按照染色強(qiáng)度對(duì)CXCL14染色進(jìn)行評(píng)分:無(wú)染色0分，淺陽(yáng)性染色1分，中陽(yáng)性染色2分，強(qiáng)陽(yáng)性染色3分。陽(yáng)性染色面積評(píng)分為:＜5%0分，5%～25%1分，26%～50%2分，51%～75%3分，＞75%4分。將強(qiáng)度分?jǐn)?shù)乘以表達(dá)分?jǐn)?shù)來(lái)計(jì)算最終分?jǐn)?shù)，評(píng)分從0分到12分［11］。

1．4ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))

經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審議批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書，于成都醫(yī)學(xué)院腫瘤科收集肝癌合并糖尿病患者血液標(biāo)本27例(其中12例用于檢測(cè)CXCL14表達(dá)情況并與正常組、肝癌未合并糖尿病組相比較，15例用于檢測(cè)CXCL14表達(dá)水平與血糖的關(guān)系)，肝癌未合并糖尿病患者血液標(biāo)本12例，體檢正常人血液標(biāo)本12例。納入標(biāo)準(zhǔn):術(shù)后病理明確診斷為肝癌;有典型糖尿病癥狀(多尿、多飲和不能解釋的體重下降)者，任意血糖≥11．1mmol/L或空腹血糖(FPG)≥7．0mmol/L，為糖尿病患者;FPG＜6．11mmol/L并且餐后2h血糖＜7．8mmol/L，為正常。排除標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前行放化療患者;合并全身疾病或其他原發(fā)性腫瘤患者。詳細(xì)記錄患者的性別，年齡，病理分期分級(jí)等病理資料。將收集的血清樣本儲(chǔ)存在－80℃直至進(jìn)一步使用。使用ELISA試劑盒(KITZOME，中國(guó)深圳)根據(jù)制造商的說(shuō)明書測(cè)量血清中CXCL14的水平并定量，每個(gè)血清樣本分析三次。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用GraphPad5．0軟件完成。定量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x珋±s)描述，組間比較采用t檢驗(yàn)。至少進(jìn)行三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。多組間的比較采用單因素方差分析(OneWayANOVA)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α除特別說(shuō)明外均設(shè)定為0．05。

2結(jié)果

2．1肝癌合并糖尿病分子標(biāo)志物的篩選

綜合分析肝癌GEO及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇含有正常肝組織和肝癌組織的三個(gè)GEO數(shù)據(jù)集(GSE46408，GSE60502，GSE46444)和TCGA－LIHC。維恩圖顯示這四個(gè)數(shù)據(jù)集之間含有21個(gè)共同差異性基因(圖1A，B)。選擇含有正常組織及糖尿病組織的兩個(gè)GEO數(shù)據(jù)集(GSE7014，GSE29221)，維恩圖顯示這兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間有137個(gè)共同差異性基因(圖1C)。將上述篩選出的21個(gè)肝癌差異性基因與137個(gè)糖尿病差異性基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，維恩圖顯示肝癌與糖尿病共同差異性基因只有一個(gè)(圖1D)。由此我們得到肝癌合并糖尿病的共同差異性基因CXCL14。隨后，根據(jù)熒光強(qiáng)度半定量檢測(cè)CXCL14在以上六個(gè)數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況，GSE46408(P=0．0004)，GSE60502(P＜0．0001)，GSE46444(P＜0．0001)，TCGA－LIHC(P＜0．0001)，GSE7014(P=0．0090)，GSE29221(P=0．0015)(圖2)。與正常組相比，肝癌組及糖尿病組中CXCL14表達(dá)明顯降低。

2．2CXCL14在組織芯片和血清中的表達(dá)情況

為了確定肝癌患者中CXCL14表達(dá)的臨床意義，我們進(jìn)行了免疫組化染色(圖3A)，通過(guò)半定量評(píng)分方法測(cè)量CX-CL14的表達(dá)水平。結(jié)果顯示肝癌組織中CXCL14的表達(dá)明顯低于正常肝組織(P=0．0002)(圖3B)。進(jìn)一步分析CXCL14在血清中的表達(dá)情況，與正常血清相比，肝癌患者血清中CXCL14下調(diào)(P=0．0192)，糖尿病患者血清中CXCL14表達(dá)水平明顯降低(P=0．0063)(圖3C)。

2．3CXCL14在肝癌合并糖尿病患者中的表達(dá)情況

收集正常組，肝癌合并糖尿病組，肝癌未合并糖尿病組血清標(biāo)本各12例，結(jié)果顯示肝癌合并糖尿病患者血清中CXCL14表達(dá)明顯低于肝癌未合并糖尿病組，組間分析P＜0．0001(圖4A)，三組間具有明顯差異。檢測(cè)15例肝癌患者血清中CXCL14的表達(dá)情況，及對(duì)應(yīng)的空腹血糖水平。相關(guān)性分析顯示，CXCL14表達(dá)越低，血糖水平越高，相關(guān)系數(shù)r=0．9005，P＜0．0001，CX-CL14表達(dá)水平與血糖濃度呈負(fù)相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

隨著生活方式的改變，糖尿病已經(jīng)成為僅次于惡性腫瘤、心腦血管疾病后，危害人類健康的第三大疾病，其發(fā)病率與死亡率呈逐年上升趨勢(shì)。在2013年，世界人群范圍中已有3．82億人患有糖尿病，預(yù)計(jì)到2035年將增加到5．92億［12］。Yancik等臨床研究證實(shí)，在校正年齡和分期后，合并糖尿病的乳腺癌患者30個(gè)月內(nèi)死亡率要比未合并糖尿病患者高76%［13］。同時(shí)另一項(xiàng)臨床研究表明，在校正年齡、性別、分期后，合并糖尿病的結(jié)腸癌患者死亡率增加37%［14］。Meyerhardt等進(jìn)行的一項(xiàng)隨機(jī)輔助化療臨床資料同樣證實(shí)，合并糖尿病的287例結(jié)腸癌患者死亡危險(xiǎn)率增加42%，腫瘤復(fù)發(fā)率增加21%［15］。所以尋找相關(guān)分子標(biāo)志物，對(duì)于早期預(yù)測(cè)肝癌合并糖尿病具有重要的臨床意義。目前認(rèn)為CXCL14是一種腫瘤抑制基因，其蛋白的表達(dá)缺失與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)［16，17］。正常肝臟組織中CXCL14高表達(dá)，肝癌組織中CXCL14的表達(dá)顯著下調(diào)［18］。研究表明，過(guò)表達(dá)CXCL14能抑制肝癌細(xì)胞的增殖，引起細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞的侵襲作用。

慢病毒上調(diào)CXCL14的表達(dá)，能明顯抑制裸鼠的皮下瘤體生長(zhǎng)。上調(diào)或重新過(guò)表達(dá)CXCL14對(duì)肝細(xì)胞癌的治療具有重要意義［19］。此外，CXCL14可增強(qiáng)胰島素誘導(dǎo)的胰島素受體和胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化［20，21］。由此可見(jiàn)，肝癌患者血清中CXCL14表達(dá)降低，CX-CL14的下調(diào)可減弱胰島素受體和胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化，降低胰島素敏感性，從而增加患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。而糖尿病患者血清中CXCL14表達(dá)進(jìn)一步降低，加劇肝癌的進(jìn)程，進(jìn)而形成惡性循環(huán)，增加患者的死亡率。因此CXCL14的表達(dá)水平在肝癌合并糖尿病患者中起重要作用。綜上所述，我們通過(guò)GEO及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析，篩選得到肝癌合并糖尿病差異性基因:CXCL14，早期檢測(cè)肝癌患者血清中CXCL14的表達(dá)水平可能作為糖尿病的一個(gè)預(yù)測(cè)指標(biāo)。但相應(yīng)的細(xì)胞及動(dòng)物層面的分子機(jī)制仍需深入研究，為其臨床轉(zhuǎn)化奠定相應(yīng)的分子基礎(chǔ)。同時(shí)，CXCL14作為新型肝癌合并糖尿病分子標(biāo)志物，其參考值范圍及檢測(cè)方法也需進(jìn)一步研究。

作者：張婷；吳東明；許穎