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摘要:現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究多借助動物模型了解疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律及其防治,疾病動物模型的構(gòu)建也因此取得了長足進步。中醫(yī)作為我國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué),在考慮疾病本身的同時,更注重病證結(jié)合治療,因此構(gòu)建病證結(jié)合動物模型更匹配中醫(yī)藥實驗研究。糖尿病腎病(Diabetickidneydisease,DKD)是糖尿病(Dia-betesmellitus,DM)最常見且最嚴重的微血管并發(fā)癥,中醫(yī)藥對其治療有著較為顯著的臨床療效,因此對其基礎(chǔ)研究就顯得十分必要,構(gòu)建適合的病證結(jié)合動物模型是實驗研究的基本手段。對DKD病證結(jié)合動物模型進行了綜述。

關(guān)鍵詞:糖尿病腎病;病證結(jié)合動物模型;綜述

高達25%~40%的糖尿病(DM)患者合并有糖尿病腎病(DKD),造成了由DKD發(fā)展成終末期腎臟疾病的顯著風(fēng)險,并增加了心血管疾病的發(fā)病率和死亡率[1]。現(xiàn)階段,西醫(yī)治療DKD多是在合理飲食和運動的基礎(chǔ)上,采用控制血糖、降血壓、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂等治療方法,但療效不甚明顯。中醫(yī)認為DKD可歸屬于“消渴”“水腫”“尿濁”“溺毒”等范疇,辨證施治可取得較好臨床療效。疾病動物模型是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗中不可或缺的研究手段之一,DKD動物模型構(gòu)建已較為成熟,基于此的中醫(yī)病證結(jié)合動物模型也有所發(fā)展,對中醫(yī)治療DKD的方藥、藥理的研究起到了巨大的推動作用。

1DKD疾病動物模型

國內(nèi)外學(xué)者對于DKD動物模型進行了大量的研究,成功構(gòu)建了許多理想的動物模型。主要分為三大類:一是誘發(fā)性DKD模型,通過化學(xué)藥物(如鏈脲佐菌素、四氧嘧啶等)誘導(dǎo)、單側(cè)或部分腎切除、高糖高脂飲食等手段建模;二是自發(fā)性DKD模型,利用其定向培育而保留下來的某些基因突變,在自然狀態(tài)下發(fā)生DKD,如NOD小鼠、Akita小鼠、db/db小鼠、BB大鼠、OLETF大鼠、GK大鼠等;三是轉(zhuǎn)基因DKD動物模型,在動物原來遺傳背景的基礎(chǔ)上,通過改變某種基因的表達水平以建立DKD動物模型,如轉(zhuǎn)基因OVE26小鼠、轉(zhuǎn)基因(mRn-2e)27大鼠等[2]。后兩類動物模型與人類DKD最為接近,是十分理想的實驗對象,但受獲取難度大、技術(shù)要求高、價格昂貴等因素的影響,應(yīng)用受到了限制;現(xiàn)階段,大多數(shù)實驗選用誘發(fā)性模型,尤其是鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘導(dǎo)的DKD模型被廣泛應(yīng)用。STZ是一種高度選擇性胰島β細胞毒性劑,小鼠、大鼠、猴等動物對其毒性作用敏感,但兔對其不敏感,現(xiàn)多用于小鼠和大鼠T1DM模型的制造,其腎臟損害與人類糖尿病腎病相似[3-4]。常用單次大劑量(小鼠≥200mg/kg,SD大鼠55mg/kg,WKY大鼠60mg/kg,SHR大鼠45mg/kg)或多次小劑量(小鼠50~70mg/kg,大鼠30mg/kg)行腹腔注射,有研究顯示多次小劑量給藥的方法造模成功率和穩(wěn)定性更優(yōu)[4-7]。此外,動物的遺傳背景、性別、附加處理方式等,對造模也有較大的影響。多次小劑量STZ誘導(dǎo)小鼠的血糖水平順序為DBA/2>C57BL/6>MRL/MP>129/SvEv>BALB/c,DBA/2小鼠的蛋白尿亦最明顯,而SD大鼠成模可能優(yōu)于Wistar大鼠;采用雄性鼠造模要優(yōu)于雌性鼠;空腹鼠的成模率要高于非空腹鼠;而單側(cè)腎切除合并尾靜脈注射STZ的高血糖情況不如單純腹腔注射STZ,但更符合DKD的病理改變,且節(jié)省實驗時間[8-11]。先通過一段時間的高糖高脂飲食誘導(dǎo)出胰島素抵抗,再配合小劑量STZ誘發(fā)胰島素分泌障礙,可以制備2型DKD模型;也有在高糖高脂飲食喂養(yǎng)之前或之后,摘除右側(cè)腎臟,造成左腎代償性肥大,能提高成模率,縮短成膜時間,且更貼近人類臨床特點[12-13]。

2DKD病證結(jié)合模型

目前DKD病證結(jié)合模型多采用疾病造模因素與證候造模因素相疊加的方式,在運用一次大劑量STZ或高糖高脂飲食+小劑量STZ的同時,配合證候動物模型的研究成果進行造模。中醫(yī)認為DKD的病機總屬本虛標(biāo)實,患者的本虛證以氣虛、陰虛、陽虛為主要表現(xiàn),標(biāo)實證中以血瘀、痰濕為主要表現(xiàn)[14]。近年來,研究者已經(jīng)構(gòu)建和使用了氣虛、氣陰兩虛、陽虛、陰陽兩虛、血瘀、氣虛血瘀、陽虛血瘀等多個病證結(jié)合模型。

2.1氣虛DKD動物模型

DKD為以虛為本,尤以氣虛最為常見,且始終貫穿于本病的始末。目前報道的氣虛證DKD造模方法有如下2種。朱國茹[15]根據(jù)內(nèi)經(jīng)“飲食自倍,腸胃乃傷”的理論,用飲食失節(jié)(饑餓48h,自由飲食2h)、肥甘過度(普通飼料摻以10%豬油)的方法制造脾氣虛模型,2周成模,然后再一次性以53mg/kgSTZ制造DM模型。申曉光[16]則先通過高糖高脂飲食+小劑量STZ造模之后,依據(jù)“勞則氣耗”的理論,將大鼠每天在水溫(37±0.5)℃、深45cm水桶中游泳,待下沉?xí)r撈出,并喂以高糖高脂飼料喂養(yǎng),連續(xù)14天后造模成功。這兩種方法都能較好地復(fù)制出氣虛證的臨床表現(xiàn),如精神倦怠萎靡、毛色無光澤、大便異常等。但應(yīng)該注意疲勞游泳試驗易致大鼠呼衰,含脂量過高的飲食也會加重腎實質(zhì)進行性損害,從而增加造模死亡率[17],因此造模時要密切關(guān)注動物的情況,采取降低游泳強度、提供有氧環(huán)境、搭配普通飲食等方式或可提升造模成功率。

2.2氣陰兩虛DKD動物模型

氣陰兩虛是DKD基本病機,病位主要在脾腎,臨床上DKD早期即表現(xiàn)出氣陰兩虛的癥狀。周雪梅等[18]給予DN模型大鼠灌胃耗氣傷陰中藥(青皮、枳殼、附子,組成比為6∶6∶5),劑量達5倍成人等效劑量(3.25g/kg/d),同時應(yīng)用益氣養(yǎng)陰中藥反證造模成功。高磊[19]連續(xù)25天使用甲狀腺素片混懸液10mg/kg/d劑量灌胃,模擬甲亢時出現(xiàn)急躁、多汗、神經(jīng)過敏、震顫、心率加快等類似于陰虛證候表現(xiàn),再配合疲勞游泳造模。胡愛民等[20]則是在饑飽失常、疲勞游泳的基礎(chǔ)上,根據(jù)“恐傷腎”“恐則氣下”理論,附以驚嚇方式進行氣陰兩虛造模。大鼠一般情況和血漿檢測顯示,怒恐情志刺激可制作肝腎陰虛證模型[21],且情志造模符合中醫(yī)七情致病理論,并能排除造模藥物干預(yù)對后續(xù)的中藥研究的不利影響,要優(yōu)于前兩種方案。2.3陽虛DKD動物模型DKD病變中期,病情遷延,則陰損及陽。陽虛動物是最早構(gòu)建的證候動物模型,多采用激素造模。吳朝妍等[22]在大劑量STZ腹腔注射3天后,臀部肌注氫化可的松注射液每只2mL(10mg),連續(xù)15天,制作大鼠糖尿病腎陽虛模型,但其死亡率接近20%(9/52)。孫紅旭等[23]用高糖高脂飼料喂養(yǎng),兩次小劑量(30mg/kg,間隔3天)腹注1周后,再予以腺嘌呤350mg/kg/d加苦寒中藥煎劑(龍膽草、梔子、番瀉葉)4mL/kg/d混合灌服,連續(xù)2周,該方法操作較為復(fù)雜,且死亡率也不低。這兩種造模方法導(dǎo)致大鼠死亡,可能與藥物的毒副作用引起代謝混亂,加重臟腑衰竭有關(guān),因此還需尋找更合適的造模手段,單獨以苦寒傷陽或許能提示動物存活率,且更具中醫(yī)特色。

2.4陰陽兩虛DKD動物模型

陰陽兩虛是DKD晚期的主要證型,但相應(yīng)病證結(jié)合模型卻鮮有報道。郭學(xué)軍[24]等在STZ(一次性55mg/kg)腹腔注射制作T1DM模型后,灌服青皮、枳殼、干姜、黃柏復(fù)方(配伍比為1∶1∶1∶1),按24g/kg給藥。李慧[25]則采用高糖高脂飲食+小劑量STZ制作T2DM模型后,應(yīng)用防己、黃柏中藥顆粒劑(配伍比為1∶1),按16.7g/kg給藥,相當(dāng)于25倍成人用量,運用其性、味的陰陽歸屬不同,過用損傷機體的陰液和陽氣,從而達到造模的目的。兩者所制造的模型均出現(xiàn)腎小球肥大、系膜基質(zhì)擴張、基底膜增厚等腎臟病理改變,以及陰陽兩虛的表現(xiàn),并使用金匱腎氣丸進行反證確認。以上兩種造模方式,均先給予STZ刺激構(gòu)建糖尿病模型,再加以中藥干預(yù)構(gòu)建證候模型,結(jié)果顯示較為符合糖尿病腎病陰陽兩虛型,造模較成功。

2.5血瘀DKD動物模型

DKD較少表現(xiàn)出單純的虛證,往往呈現(xiàn)虛實夾雜的狀況;血瘀證作為DKD的主要兼證,貫穿了整個病程的始終。王輝等[26]在一次性大劑量STZ造模成功7周后,皮下注射腎上腺素注射液(0.8mL/kg,2次,間隔4h)模擬暴怒時機體狀態(tài),在注射間隔期間,大鼠浸入冰水5min模擬寒邪侵襲,建立DKD血瘀模型,模型的全血黏度和血漿黏度均明顯升高。也有學(xué)者[27-28]發(fā)現(xiàn)單純使用高糖高脂飲食+STZ造模的大鼠,也可出現(xiàn)爪掌、尾靜脈的紫暗瘀血,且血脂、血黏度均升高,具備血瘀、痰濁證的特點。高磊[19]則是DN模型制作成功后,采用甲狀腺素+力竭性游泳進行造模,水溫控制在8℃,通過“寒則收引”產(chǎn)生血瘀,持續(xù)14天,氣陰兩虛血瘀證造模成功。李海霖等[29]使用真空干燥箱模擬高原地區(qū)低壓、缺氧的特點,每天3.5h;再放入冰箱冷藏室中對大鼠進行寒冷刺激3.5h,共35天;在建立證候模型的同時,腹腔一次性注射50mg/kg的STZ,構(gòu)建高原陽虛血瘀型DKS大鼠模型。根據(jù)導(dǎo)致血瘀的主因不同采取不同的干預(yù)方式造模,但基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論均采用了寒冷刺激,且STZ兩者都選用了,進一步說明了STZ在糖尿病腎病造模中的重要性及應(yīng)用的廣泛性。

3結(jié)語

辨證論治是中醫(yī)學(xué)理論體系的主要特點之一,構(gòu)建符合中醫(yī)學(xué)理論的證候動物模型是中醫(yī)藥實驗研究中十分關(guān)鍵的內(nèi)容。證候動物模型研究始于上世紀60年代,已有50多年的研究歷程,現(xiàn)已能夠復(fù)制百余種證型,覆蓋八綱、六淫、情志、臟腑、氣血津液、六經(jīng)、衛(wèi)氣營血辨證等。DKD病證結(jié)合模型即是結(jié)合疾病動物模型和證候動物模型的造模方法,既擁有其疾病特點,又有符合相應(yīng)證候特征,保留了病與證的精密關(guān)系,有助于更全面、客觀地研究中醫(yī)藥防治DKD的作用及其機制。然而,現(xiàn)階段DKD病證結(jié)合模型的研究仍然存在很多問題:證候類別偏少,臨床DKD的證候呈現(xiàn)虛實夾雜、復(fù)雜多樣的特點,現(xiàn)有的模型過于局限;造模方法不統(tǒng)一,相同證型的可采用多種方式造模,且干預(yù)藥物及其劑量也存在著較大差異;評價指標(biāo)不標(biāo)準,實驗動物與人的臨床表現(xiàn)不盡相同,套用人的證候表現(xiàn)并不完全合適,同時造模后常多種證候交疊出現(xiàn),難以明確區(qū)分。上述問題影響了DKD病證結(jié)合模型的代表性和可信度,致使其應(yīng)用并不廣泛,當(dāng)前大多數(shù)中醫(yī)藥防治DKD的研究使用的仍是DKD疾病動物模型。但相信隨著相關(guān)研究的不斷完善,DKD病證結(jié)合模型將對中醫(yī)藥防治DKD研究作出更大貢獻。

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作者：文雪1；馬躍榮2單位：1.成都中醫(yī)藥大學(xué)2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/四川省中醫(yī)院病理科