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智能藥物載體是指能改變藥物進入人體內的方式和分布、控制藥物釋放速度并將其輸送到靶器官的體系。該體系可防止藥物在短時間內降解、失活、排泄以及發生人體免疫反應[1,2]。藥物分子與載體通常有兩種交聯方式:其一是藥物分子與載體通過共價鍵結合,即化學交聯;其二是載體通過靜電吸引、包埋等非共價鍵分子間作用力與藥物分子結合,即物理交聯。近年來,文獻[35]報道了pH響應型、溫度響應型等智能藥物載體。還原響應型的智能藥物載體由于其高效的釋放效果也引起了人們極大的關注[6]。

還原響應型的藥物載體是通過在載體與藥物分子之間用具有還原響應性的二硫鍵連接或用二硫鍵連結的兩嵌段共聚物與藥物分子在溶劑中自組裝形成納米結構的微粒給藥系統。二硫鍵具有如下特點:在人體的正常體溫、pH和氧化等環境下非常穩定,在一定量的谷胱甘肽(GSH)還原酶或二硫蘇糖醇(DTT)等還原劑存在下被還原生成巰基。細胞內外恰好存在氧化還原電位,細胞內的谷胱甘肽濃度(0.5～10mmol·L1)是細胞外谷胱甘肽濃度(2～20umol·L1)的200倍以上,細胞外的谷胱甘肽濃度不足以還原二硫鍵[7]。另外,腫瘤組織細胞比正常組織細胞缺氧,更具有還原性環境。因此,含有二硫鍵的藥物和載體通過細胞內吞作用進入靶細胞后被GSH還原,即連接藥物和載體的二硫鍵斷裂生成巰基,從而有效快速地釋放藥物,載體材料如聚乙二醇(PEG)、聚己內酯(PCL)、聚苯硫醚、聚乙烯亞胺(PEI)、碳納米管和聚賴氨酸等大都可生物降解,對細胞毒副作用小,輸送藥物至靶細胞后便可分解或經其他組織代謝排出體外,是理想的藥物載體[8]。

1與藥物分子基于共價鍵結合的還原響應載體許多藥物分子含有氨基或羧基的支鏈,可以通過生成肽鍵的方式對藥物分子進行吡啶巰基修飾,然后通過二硫鍵交換反應可以制備以二硫鍵連接的藥物與載體偶聯物。研究表明,藥物經過這種修飾后并沒有降低活性,反而提高了在運輸過程中的穩定性,減少了流失,提高了藥效[9]。但是,若直接用巰基功能化的載體分子與巰基功能化的藥物分子在氧化條件下進行偶聯,不僅會使部分藥物分子失活,而且會得到3種二硫鍵偶聯產物:藥物分子間偶聯物、載體分子間偶聯物以及藥物分子與載體分子偶聯物。為了得到藥物分子與載體分子的偶聯物,可以用2-巰基吡啶功能化的載體與巰基化的藥物分子進行偶聯[10]。

1.1與藥物偶聯的還原響應性聚合物載體Ranucci等

通過采用二硫鍵連結的方式制備聚丙烯酰胺和膽固醇的偶聯物。結果表明,該偶聯物能在水中自組裝成粒徑為110～260nm的核殼結構的粒子,膽固醇負載量約為16.4%。親水的聚丙烯酰胺在殼層,親油的膽固醇在核層。細胞實驗表明,該偶聯物具有良好的生物相容性和生物降解性,毒副作用還有待進一步研究。聚丙烯酰胺膽固醇的偶聯分子見圖1(根據文獻[11]重繪)。

Flanary等[12]報道了用聚2-丙基丙烯酸通過二硫鍵的方式交聯卵清蛋白。具體地,用聚2-丙基丙烯酸巰基乙酸酯與二硫代二吡啶通過二硫鍵交換反應生成聚2-丙基丙烯酸巰基乙酸酯吡啶二硫化物(PPAA-SS-PDSA),再與巰基化的卵清蛋白通過二硫鍵交換反應生成聚2-丙基丙烯酸卵清蛋白二硫化物(PMAA-oalbumin)的偶聯物。研究表明,這種偶聯物不僅在pH=6～6.5區間有pH響應性,而且還具有還原響應性,卵清蛋白負載量約為53%。在巨噬細胞和B3ZT細胞培養液中加入一定濃度的該偶聯物后,沒有發現這兩種細胞數目減少,說明該偶聯物細胞毒性很小,生物相容性較好,從提高CD8免疫細胞的數量來看,交聯后的卵清蛋白活性比自由的卵清蛋白還要高22倍。

Vlies等[13]用吡啶二硫功能化的聚苯硫醚納米粒和帶巰基的小分子、生物素、多肽以及蛋白等藥物通過二硫鍵交換反應制備了粒徑在30～50nm之間的納米粒交聯物,交聯后粒子粒徑改變量小于25nm,藥物分子的性質并未改變,在磷酸三(2-氯乙基)酯還原劑下斷裂二硫鍵快速釋放藥物,這種藥物載體在藥物運輸方面有很大的應用前景。Navath等[14]報道用巰基修飾的六臂聚乙二醇(6-Arm-PEG-SH)和S-S''''-二巰基吡啶N-乙酰半胱氨酸(NAC-TP)在磷酸緩沖溶液(PBS)中合成了一種星形聚合物載體－六臂聚乙二醇二硫乙酰半胱胺酸聚合物(6-Arm-PEG-SS-NAC),粒徑為30～40nm,分子質量10.33kD。細胞實驗表明,這種偶聯物在2～10mmol·L1谷胱甘肽濃度中2h內釋放75%的NAC。這種載體可以增加NAC的水溶性,提高了藥物在血液中的運輸能力,減少了藥物流失,增加了藥效。6-Arm-PEG-SS-NAC的合成及在細胞內被GSH還原釋放HS-NAC的示意圖見圖2(根據文獻[14]重繪)。

1.2與藥物偶聯的還原響應性碳納米管最近碳納米管的生物醫學應用價值備受關注。通過對碳納米管進行修飾并且與生物活性物質共價結合,可用于藥物和生物大分子傳遞系統[15]。研究結果顯示,利用碳納米管負載抗腫瘤藥物阿霉素,具有很高的負載容量和對腫瘤細胞有較高的選擇性,進而能夠延長阿霉素在血液中的循環時間、增加腫瘤組織對其的吸收、提高療效并顯著地降低毒副作用[16,17]。經巰基修飾的碳納米管與藥物通過二硫鍵結合后具有還原響應性。You等[18]報道了通過二硫鍵將牛血清蛋白連結在碳納米管上。具體做法是,在硝酸酸化的條件下,對碳納米管外圍進行羧酸功能化,再將羧酸基團與二硫代吡啶功能化的半胱胺在二環己基碳二亞胺(DCC)的作用下進行縮合生成酰胺鍵,然后通過二硫鍵交換反應把牛血清蛋白以二硫鍵連接在碳納米管表面。結果表明,這種碳納米管修飾的牛血清蛋白的性質沒有改變,它的釋放速率由細胞中的谷胱甘肽濃度控制。

1.3與藥物偶聯的還原響應性聚賴氨酸聚賴氨酸作為載體具有如下優點:對生物膜有良好的穿透力,不被溶酶體分解,巰基修飾后生理效應不會改變,在人體內可分解為人體必需的賴氨酸。聚賴氨酸分子含有1個氨基可以與N-琥珀酰-3-聯巰基吡啶(SPDP)生成肽鍵進行巰基修飾。甲氨蝶呤(MTX)具有細胞毒性,通過將其與聚賴氨酸偶聯后毒性降低,療效卻大大提高。該藥物載體進入細胞后,連接甲氨蝶呤與載體的二硫鍵被還原斷裂從而釋放甲氨蝶呤[19]。Lim等[20]研究了含聚賴氨酸側鏈的類似穿膜肽的多肽和半胱胺用二硫鍵交聯后在細胞中的行為,并用高效液相色譜(HPLC)跟蹤二硫鍵交換反應過程,發現其在細胞中二硫鍵的裂解和形成處在動態平衡狀態。這種多肽釋放半胱胺后被排出細胞外,在細胞外可再與半胱胺結合又進入細胞,為尋找一種可循環利用的藥物載體提供新的思路。聚賴氨酸和半胱胺結合的平衡可逆過程見圖3(根據文獻[20]重繪)。

2與藥物分子基于非共價鍵結合的還原響應載體

2.1還原響應性的納米聚合物膠束聚合物膠束是一類由兩親性嵌段共聚物形成的膠束體系。在水溶液中,當兩親性嵌段共聚物或A-B接枝共聚物的親水嵌段長度較長時,共聚物能形成核殼球形膠束[21]。兩親性嵌段共聚物的臨界膠束濃度(CMC)值越低,形成的膠束在介質中越穩定,即使在低濃度下,也能持膠束狀[22]。用二硫鍵連接的兩嵌段共聚合物與疏水的藥物分子在水中自組裝成膠束后便具有還原響應性。

鐘志遠等[23]報道了用親水的聚乙二醇和疏水的聚己內酯合成了生物可降解的(聚乙二醇)-二硫-(聚己內酯)兩嵌段共聚合物(PEG-SS-PCL)。研究表明,該嵌段聚合物在水溶液中能與阿霉素自組裝形成粒徑在200nm左右的膠束,CMC為9.3μg·mL1,包封率達到60%。在GSH為10mmol·L1條件下,模擬人體生理環境的細胞實驗顯示,這種載體可在12h左右釋放95%包裹的阿霉素,而在非還原性條件下12h只有20%阿霉素釋放出來。該課題組[24]在此研究基礎上用葡聚糖代替聚乙二醇合成了(葡聚糖)-二硫-(聚己內酯)兩嵌段共聚合物,包裹阿霉素后粒徑沒有很大改變,仍在30～50nm之間,而包封率由以前的60%提高到了70%。在GSH約為10mmol·L1條件下,模擬人體生理環境,發現10h左右可以完全釋放阿霉素,由于葡聚糖比聚乙二醇具有更好的生物相容性和水溶性,所以藥物釋放速度更快,抗癌效果更好(根據文獻[24]重繪)。Tang等[25]報道合成了聚己內酯和聚乙基乙烯磷酸酯(PCL-SS-PEEP)兩嵌段共聚合物,具體是在辛酸亞錫的催化下進行己內酯的開環聚合,然后與2-巰基乙醇生成巰基化的聚己內酯(PCL-SH),乙基乙烯磷酸酯開環聚合后的產物與2-(2-吡啶二硫)乙醇反應生成聚乙基乙烯磷酸鹽(PEEP-Py),PCL-SH和PEEP-Py在氮氣的保護下通過硫硫鍵的交換反應生成了還原響應性的PCL-SS-PEEP兩嵌段聚合物,該聚合物與藥物分子在水中自組裝成70nm左右的膠束,其CMC約為3.1mg·mL1,包封率為28%。研究表明,包裹阿霉素后能提高對A549腫瘤細胞的抑制作用,改善抗腫瘤藥物的療效,但該載體對阿霉素包封率低。Kim等[26]研究了聚乙二醇單甲醚和聚己內酯用3個半胱胺偶聯的聚合物(mPEG-Cys-PCL)和阿霉素在水中的自組裝,發現該聚合物在其較低的臨界濃度(0.07mg·mL1)下能形成210nm左右的膠束,加之半胱胺上的巰基相互交聯形成二硫鍵,導致該載體穩定性較好,阿霉素的包封率為26.8%,在模擬人體血液環境下持續釋放阿霉素可達24h,有望在臨床上應用。

2.2還原響應性的納米囊泡與簡單的嵌段共聚合物膠束相比,嵌段共聚物締合結構納米囊泡的載藥量更大而且可調控,納米囊泡具有雙層膜結構,與細胞膜有良好的相容性和滲透性,可承載的藥物類型更廣泛。納米囊泡通常是由改變大分子嵌段共聚物的親水基和相對分子質量的大小而形成的[27]。嵌段聚合物中含有二硫鍵的納米囊泡在還原條件下二硫鍵被還原裂解從而使納米囊泡解體,其中的藥物快速釋放出來。

Cerritelli等[28]合成了聚苯丙烯硫化物和聚乙二醇嵌段共聚物(PEG17-SS-PPS30)嵌段共聚物,在水中自組裝形成120nm囊泡包裹阿霉素,大鼠巨噬細胞株細胞實驗顯示這種囊泡在細胞中(相當于10mmol·L1DTT還原條件)10min后可檢測到用鈣黃綠素標記的阿霉素發出的熒光。在載藥囊泡細胞毒性實驗中,并沒有觀察到細胞顯著減少,表明這種載體沒有明顯的細胞毒性。用PEG17-PPS30-PEG17形成的囊泡包裹阿霉素做對照實驗,在2h后才檢測到微量的熒光,這可能是因為囊泡溶脹致使阿霉素釋放出來。由此可知,還原響應性的囊泡能迅速釋放藥物,這對臨床應用快速殺死癌細胞具有積極的意義。PEG17-SS-PPS30的合成路線見圖5(根據文獻[28]重繪)。圖5PEG17-SS-PPS30的合成路線[28]Park等[29]研究用表面巰基修飾的葫蘆[6]脲(CB[6])制備還原響應性的納米囊泡。這種納米囊泡負載阿霉素后通過細胞高選擇性的內吞作用進入腫瘤細胞,在腫瘤細胞的GSH還原性環境下二硫鍵裂解致使納米囊泡解體從而迅速釋放阿霉素。

2.3還原響應性的納米中空微球聚合物中空微球在結構上類似于囊泡,但是中空微球并非由嵌段共聚合物制得,而是用層層自組裝(LBL)技術制得。還原響應的中空微球是用生物可降解的且帶有二硫鍵的聚合物材料作為球殼,內部負載多肽和蛋白類藥物。當在細胞內的還原條件下,殼層二硫鍵裂解釋放藥物[30]。Chong等[31]通過LBL技術構建了聚丙烯酸(PMA)聚乙烯吡咯烷酮(PVPON)二硫偶聯的中空微球,壁厚由聚丙烯酸和聚乙烯吡咯烷酮的投料比決定。當在細胞還原條件下,二硫鍵交聯的殼層隨二硫鍵的裂解而層層地脫落,從而釋放藥物。Shu等[32]報道采用LBL技術合成了一種梯級交聯的具有還原響應和pH響應的納米中空微球。先用β-環糊精修飾的硅球吸附胱氨酸交聯的殼聚糖或巰基修飾葡聚糖形成殼層,再用氫氟酸去掉硅核,牛血清蛋白則留在β-環糊精的空腔里面。這種微球粒徑分布在90～120nm,能被細胞膜內吞,在細胞內還原環境下脫除外殼,釋放牛血清蛋白。

2.4還原響應性的脂質體脂質體具有兩親性,藥物被脂質體包封后,具有以下主要特點:溶解性增強、毒性降低、靶向性增強以及緩釋作用增加。因此,如用脂質體將對正常細胞有毒性的抗癌藥物包封后,可明顯降低藥物的毒性[33]。還原響應性的脂質體是由二硫鍵連結兩親性物質構成的[34]。包裹疏水性藥物后,在細胞還原性物質下(如DTT或GSH)斷裂二硫鍵快速釋放藥物。Maeda等[35]先用3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP)處理過的二油酰基磷酰基乙醇胺(DOPE)和巰基化的單甲醚聚乙二醇(mPEG-SH)通過二硫鍵交換反應合成了mPEG-SS-DOPE,再在4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖溶液中及二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)的存在下合成了一種含有二硫鍵的脂質體(mPEG-SS-liposomes),該脂質體在HEPES緩沖溶液中和精氨酸八聚體(R8)結合生成了一種還原響應型的脂質體(mPEG-S-S-R8-liposomes),經過動態光散射測定其粒徑在100nm左右。細胞實驗結果表明,在10mmol·L1GSH條件下,4h后可檢測到100%A431腫瘤細胞內吞的鈣黃綠素發出的熒光。該類脂質體對藥物的包封率最高,且毒副作用最小。該脂質體的結構示意圖見圖6(根據文獻[35]重繪)。

3還原響應型藥物載體在基因給藥系統中的應用

基因治療是在細胞生物學、分子生物學以及病毒學等學科飛速發展的基礎上建立起來的一項新技術。利用該技術將人或動物的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式轉入人體靶細胞內表達,以糾正基因缺陷或發揮治療作用。基因治療的一個關鍵技術是基因傳遞載體的設計。非病毒的還原響應型聚合物載體具有低毒、低免疫原性、能攜帶大量DNA分子、易大量生產和費用低廉等特點,引起了人們極大的興趣[36]。

3.1基于靜電作用的還原響應型基因傳遞系統聚乙烯亞胺(PEI)是目前在基因給藥載體領域非病毒載體應用最廣泛的一類高分子載體,它價格低廉、體內外轉染效率較高。PEI單體中含有兩個碳原子和1個氮原子,分枝狀的PEI分子中可含有伯胺、仲胺和叔胺,每個胺都可以質子化,從而帶上大量的正電荷,通過靜電作用包裹DNA或siRNA。與二硫鍵形成的分枝狀和線型的PEI包裹DNA后,在靶細胞中的GSH還原下,隨著二硫鍵斷裂而分散,從而釋放DNA[37]。這種載體在細胞外穩定性較好,但高分子量的PEI毒性較大,若用PEG、PCL、殼聚糖等修飾PEI,既降低了毒性又增加了其轉染效率[38]。還原響應的枝化和線型PEI見圖7(根據文獻[39]繪制)。

PEIOu等[40]用N,N''''-二丙烯酰胱胺(CBA)分別與精胺(SP)、三乙烯四胺(TETA)、N,N''''-雙(2-氨乙基)丙三胺(AEPD)、N,N''''-雙(2-氨乙基)乙二胺(APED)等合成了一系列含有二硫鍵的聚合物,研究發現聚合鏈的長度并不影響基因的轉染效率,該聚合物比枝狀的聚乙烯亞胺具有更高的質子化程度,更低的細胞毒性、更強的細胞靶向性。

Kim等[41]發現用精氨酸接枝的聚二硫胺能與質粒DNA通過靜電作用形成小于200nm的納米粒,通過奎寧處理后發現其轉染效率并沒有改變,這說明不是由于精氨酸的接枝增加了該載體的細胞膜穿透能力,而是增加了核定向能力。Waite等[42]利用RGD肽作為藥物靶向配體的性質,研究用聚酰胺(PAMA)、RGD肽的偶聯物(PAMA-SS-RGD)和siRNA形成復合物來運載目的基因,既消除了細胞外基質的相互作用,又提高了siRNA的傳遞作用。

3.2基于共價鍵和非共價鍵雙重作用的還原響應型基因傳遞系統基于靜電作用的基因傳遞系統雖然易于細胞內在化、從內涵體逃逸、保護DNA免受DNA酶的降解,但是強烈的靜電作用限制了基因進入細胞核后從復合物中釋放,基于共價鍵和非共價鍵雙重作用的還原響應基因傳遞系統在一定程度解決了這個問題。Kim等[43]用巰基化的聚乙二醇(mPEG-SH,Mr=5000)和血管內皮生長因子siRNA經SPDP處理后的2-吡啶基二硫siRNA合成了siRNA-SS-PEG的偶聯物,該偶聯物和PEI組裝成的聚電解質復合物膠束(PEC)在血管內皮生長因子siRNA降解酶存在下表現良好的穩定性,而在細胞內GSH的還原下能夠迅速釋放攜帶的siRNA。這類載體綜合了PEI的高轉染性和PEG的低毒性,具有較大的應用前景。PEG和siRNA的偶聯物合成路線圖見圖8(根據文獻[43]重繪)。

4結語

隨著科技的發展,人們對疾病的治療效果和治療手段的要求也日益提高。提高藥物的生物利用度、延長藥物作用時間、實現藥物體內靶向定位,降低毒副作用一直是藥物載體領域研究的重點。以還原響應型藥物載體為代表的可控的緩釋智能藥物載體以其高效釋放藥物、毒副作用小和生物可降解的優點將具有更廣闊的發展前景,智能釋放和可控程度是這一體系的關鍵。就目前情況來看,許多藥物載體仍存在研制成本高、包封率低、適用范圍窄、臨床應用率不高等問題。今后的研究方向應是進一步提高藥物載體的可控程度、提高載藥性、降低毒副作用、提高生物降解能力及靶向定位等。相信在不久的將來,還原響應型等智能型藥物載體將在臨床上得到廣泛的應用,成為人類征服疾病的有力武器。