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類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種慢性自身免疫性疾病，存在多基因、多通路、多途徑的分子功能網(wǎng)絡(luò)相互作用的復(fù)雜病理過(guò)程［1-2］。RA屬于中醫(yī)的“痹證”范疇，其證候多樣，但寒、熱證候?qū)傩蕴卣髯顬槊黠@，在臨床辨證論治中的價(jià)值也最大［3］。辨證施治、“藥-證對(duì)應(yīng)”是中醫(yī)的基本治則，雖然已有大量RA中醫(yī)治療的臨床和實(shí)驗(yàn)報(bào)道，但RA“藥-證對(duì)應(yīng)”的分子機(jī)制尚不清楚。隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(NetworkPharmacology)應(yīng)運(yùn)而生，它在網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)與多向藥理學(xué)的基礎(chǔ)上提出的藥物設(shè)計(jì)的新思想［4-5］。研究中藥多靶點(diǎn)的藥理作用機(jī)制及復(fù)雜疾病網(wǎng)絡(luò)，最有可能揭示辨證施治的分子基礎(chǔ)。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，應(yīng)用文本挖掘和生物信息學(xué)技術(shù)，以RA熱證為切入點(diǎn)，通過(guò)構(gòu)建、分析RA熱證的分子生物網(wǎng)絡(luò)以及對(duì)證中藥的藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，尋找RA熱證“藥-證對(duì)應(yīng)”的靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)和生物學(xué)通路，初步探索RA熱證“藥-證對(duì)應(yīng)”的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1方法

1．1基于RA熱證的對(duì)證中藥定向文本挖掘文本挖掘分為文本數(shù)據(jù)收集、處理、結(jié)構(gòu)化分析、可視化以及評(píng)價(jià)5個(gè)步驟［6］。首先，登錄中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索關(guān)鍵詞“類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎OR類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎”。文獻(xiàn)14435篇(檢索日期:2011年9月15日)。將收集來(lái)的數(shù)據(jù)，以ANSI編碼格式保存。利用文本提取工具，對(duì)下載的非結(jié)構(gòu)化的TXT文本數(shù)據(jù)進(jìn)行信息提取，保存成格式化的、便于數(shù)據(jù)庫(kù)(Access)和大型數(shù)據(jù)庫(kù)(MicrosoftSQLServer，SQL)處理的格式。通過(guò)關(guān)鍵詞對(duì)構(gòu)造算法［7］進(jìn)行數(shù)據(jù)清洗工作。然后結(jié)合專業(yè)知識(shí)進(jìn)行解析，繼續(xù)按關(guān)鍵詞對(duì)構(gòu)造算法進(jìn)行噪音清洗，直到噪音降到滿意為止。然后，結(jié)合中醫(yī)證候要素特點(diǎn)進(jìn)行定向文本挖掘，在RA數(shù)據(jù)集內(nèi)，按照“熱”為關(guān)鍵詞對(duì)文獻(xiàn)的主題詞進(jìn)行檢索，將數(shù)據(jù)集定義為“熱”子集。然后，針對(duì)這個(gè)數(shù)據(jù)子集，分別執(zhí)行后續(xù)的計(jì)算［7］。經(jīng)過(guò)計(jì)算，可以得到中醫(yī)治療RA熱證要素的中藥用藥規(guī)律。用可視化軟件Cytoscape2．8．2進(jìn)行可視化處理，并以網(wǎng)絡(luò)圖的形式展現(xiàn)出來(lái)。

1．2PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)搜索藥物靶蛋白將定向文本挖掘出的對(duì)證治療RA熱證的中藥分別輸入PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)［8］檢索，找到每種有效成分的人類活性靶蛋白。

1．3基因芯片分析典型RA熱證與正常人外周血CD4+T細(xì)胞差異基因中日友好醫(yī)院門(mén)診病人中，隨機(jī)選取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的早期RA女性患者，RA證候問(wèn)卷表采集患者各項(xiàng)證候信息，參照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行寒、熱證候判斷，篩選出符合納入標(biāo)準(zhǔn)的RA女性熱證患者12名。同時(shí)按照排除標(biāo)準(zhǔn)選取中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院12名健康志愿者(年齡在18歲至70歲之間)作為對(duì)照組。采集RA熱證患者及健康人空腹靜脈血，分離純化得到CD4+T淋巴細(xì)胞，用于基因表達(dá)譜芯片分析。比較RA熱證與正常人差異基因，選取1．4倍以上的上調(diào)及下調(diào)的差異基因分析，具體分析步驟見(jiàn)本課題組前期研究報(bào)道［9］。

1．4分別構(gòu)建RA熱證對(duì)證中藥靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)及RA熱證生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行對(duì)應(yīng)分析利用IPA(IngenuityPathwayAnalysis)生物分析軟件，在線提交定向文本挖掘出的基于RA熱證對(duì)證藥物的靶蛋白列表及RA熱證與正常人差異基因列表。分別構(gòu)建基于RA熱證對(duì)證中藥靶標(biāo)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及基于RA熱證與正常人比較差異基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用軟件中的Network、CanonicalPathway、Functions及Comparison等功能模塊進(jìn)行分析，獲得藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)功能及重要生物學(xué)通路。同時(shí)，比較藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)和RA熱證分子網(wǎng)絡(luò)，尋找和分析二者的生物學(xué)通路的異同。

2結(jié)果

2．1RA熱證定向文本挖掘結(jié)果通過(guò)定向文本挖掘，篩選出治療RA熱證的4個(gè)常用中藥:黃柏、知母、蒼術(shù)及牛膝，將其作為研究的對(duì)象，見(jiàn)圖1。

2．2RA熱證對(duì)證中藥靶蛋白及靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)通過(guò)檢索PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)，分別找到RA熱證的對(duì)證中藥:黃柏、知母、蒼術(shù)及牛膝4味中藥共有靶蛋白123個(gè)(略)。通過(guò)IPA軟件將這些靶蛋白構(gòu)建RA熱證的對(duì)證中藥靶蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2A所示。經(jīng)IPA分析，該網(wǎng)絡(luò)排名前5位的生物學(xué)功能見(jiàn)表1。

2．3RA熱證與正常人差異基因生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)及功能RA熱證與正常人CD4+T淋巴細(xì)胞的差異基因中，上調(diào)基因15個(gè)，下調(diào)基因6個(gè)，詳見(jiàn)本課題組前期研究報(bào)道［9］。基于上述差異基因和IPA構(gòu)建的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2B。經(jīng)IPA分析，該網(wǎng)絡(luò)主要生物學(xué)功能見(jiàn)表2。

2．4RA熱證差異基因及其對(duì)證中藥靶蛋白的共同生物學(xué)通路在IPA系統(tǒng)的Comparison功能中，比較RA熱證差異基因及其對(duì)證中藥靶蛋白的共同生物學(xué)通路，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞免疫反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路中，二者都參與了共同的生物學(xué)通路:GM-CSF信號(hào)通路，CTLA4信號(hào)通路，T細(xì)胞受體信號(hào)通路及輔助T細(xì)胞中的CD28信號(hào)通路，如圖3～4所示。在圖4中，我們可以看到，這4條生物學(xué)通路中，RA熱證差異基因及其對(duì)證中藥靶蛋白都有參與，但作用的靶點(diǎn)并不盡相同。在GM-CSF信號(hào)通路中(圖4，A)，RA熱證與正常人比較，BCL2A1(Bfl-1)基因表達(dá)上調(diào)，而RA熱證對(duì)證藥靶點(diǎn)為GM-CSF信號(hào)通路中的AKT和Bcl-xL，這些分子最終共同干預(yù)細(xì)胞的存活及增殖。在細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞中CTLA4信號(hào)通路(圖4，B)、T細(xì)胞受體信號(hào)通路(圖4，C)及輔助T細(xì)胞中的CD28信號(hào)通路(圖4，D)中，RA熱證與正常人比較，上調(diào)了通路中的CTLA4基因，而對(duì)證中藥靶點(diǎn)為AKT和NF-κB，都通過(guò)信號(hào)通路的網(wǎng)絡(luò)影響到整個(gè)通路的生物學(xué)功能。

3討論

文本挖掘技術(shù)能以線性和非線性方式解析數(shù)據(jù)，且能進(jìn)行高層次的知識(shí)整合，又善于處理模糊和非量化數(shù)據(jù)［10］。大量的中醫(yī)藥臨床報(bào)道積累了豐富的文本數(shù)據(jù)，為文本挖掘提供了充分的數(shù)據(jù)條件［7，11］。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(Protein-proteinInteractionNetwork)是研究生物功能或病理變化分子基礎(chǔ)的新途徑和新方法，也是目前國(guó)際上生物信息學(xué)研究的熱點(diǎn)之一［12，13］。發(fā)現(xiàn)并建立與疾病相關(guān)的分子作用網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于認(rèn)識(shí)復(fù)雜疾病至關(guān)重要，也是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究所面臨的重大挑戰(zhàn)［14］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基本思路是理解疾病“表型-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)特征，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析，觀察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，尋找可能的組合藥物靶標(biāo)，預(yù)測(cè)最優(yōu)化的組合藥物［15］。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)關(guān)鍵技術(shù)研究，對(duì)于發(fā)現(xiàn)新藥、預(yù)測(cè)藥效及藥理機(jī)制既是方法學(xué)創(chuàng)新，又具有重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益［16］。RA屬于中醫(yī)中藥的優(yōu)勢(shì)病種，“方-證對(duì)應(yīng)”、“藥-證對(duì)應(yīng)”是中醫(yī)藥治療的主流方向，研究中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)的關(guān)鍵技術(shù)和方法有望直觀而深入地解釋中醫(yī)辨證論治的物質(zhì)基礎(chǔ)。PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)是由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)建立的關(guān)于小分子生物活性的公共數(shù)據(jù)庫(kù)［17］。通過(guò)其中豐富的物質(zhì)、化合物和生物活性信息，以及數(shù)據(jù)庫(kù)自身對(duì)這些信息進(jìn)行整合分析的功能，檢索治療RA熱證的中藥，可以找到黃柏、知母、蒼術(shù)、牛膝共123個(gè)，作為我們構(gòu)建熱證對(duì)證中藥靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的分子基礎(chǔ)。IPA8．7生物分析軟件［18］能夠分析、整合、理解來(lái)自于基因表達(dá)等系統(tǒng)生物學(xué)、組學(xué)等的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù);能夠搜索到有關(guān)基因、蛋白質(zhì)、化學(xué)品和藥物的信息，并能建立起實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的交互模型。在本研究中，我們除了利用IPA平臺(tái)建立了RA熱證生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)和熱證對(duì)證中藥靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)利用IPA軟件中ComparisonAnalysis分析功能對(duì)RA熱證對(duì)證中藥靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)與RA熱證與正常人差異基因的分子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)二者網(wǎng)絡(luò)的異同點(diǎn)，以及二者生物學(xué)通路的異同點(diǎn)，進(jìn)而尋找“藥-證對(duì)應(yīng)”的生物學(xué)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，RA熱證差異基因及其對(duì)證中藥靶蛋白的共同生物學(xué)通路，都參與了細(xì)胞免疫反應(yīng)相關(guān)的4條共同的生物學(xué)通路:GM-CSF信號(hào)通路，細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞中CTLA4信號(hào)通路，T細(xì)胞受體信號(hào)通路及輔助T細(xì)胞中的CD28信號(hào)通路。這4條信號(hào)通路都是參與體內(nèi)細(xì)胞免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)等生命活動(dòng)的重要生物學(xué)通路，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用［19-21］。其中，一些通路的重要靶點(diǎn)，已經(jīng)被研究者甚至美國(guó)FDA列為治療RA的靶標(biāo)，如GM-CSF［21］，CTLA4［22］。RA熱證的疾病狀態(tài)和對(duì)證中藥的干預(yù)靶點(diǎn)，都能作用在相同的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，干預(yù)通路中的相同或不同的關(guān)鍵分子，進(jìn)而影響整個(gè)通路的生物學(xué)功能。這也許就是對(duì)證中藥治療RA熱證“藥-證對(duì)應(yīng)”的分子生物學(xué)機(jī)制之一，但還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)剛剛起步，其研究手段、計(jì)算方法及應(yīng)用軟件還處在探索階段［23］。基于大量數(shù)據(jù)庫(kù)和算法構(gòu)建的分子網(wǎng)絡(luò)及藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，具有一定的預(yù)測(cè)性，還需要進(jìn)一步實(shí)證實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。但無(wú)疑，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為探索中醫(yī)“藥-證對(duì)應(yīng)”及辯證施治的生物學(xué)基礎(chǔ)開(kāi)辟了一條高通量的途徑，并為開(kāi)發(fā)基于證候的優(yōu)化藥物組合、臨床用藥及新藥研發(fā)提供了新思路、新方法。