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一、方法

1.天珠散樣品的紅外光譜鑒別傅里葉變換紅外光譜法（Fouriertransforminfraredspectroscopy，FTIR）是一種常用的結構分析技術，可宏觀整體鑒定復雜體系，具有無損、快速、簡便等特點，是鑒定未知混合物化學組成和化學結構的有效方法之一，逐漸被應用于中藥的真偽優劣鑒別[11-12]。將天麻、延齡草、天珠散超微粉碎。超微粉分別與溴化鉀混合，研磨均勻，壓片后進行FTIR光譜測定，獲得一維紅外光譜圖。

2.海馬組織全基因組芯片檢測

2.1慢性低灌注型VD模型制備及給藥參考文獻[13]方法，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35g/kg）進行麻醉，仰臥位固定，頸正中備皮消毒，切開1.5-2.0cm切口，分離雙側頸總動脈，用手術線將雙側頸總動脈永久結扎（commoncarotidartery，CCA），完成后，肌肉恢復原位，縫合。同條件正常飼養60d（說明：本實驗室已建立了穩定的慢性低灌注型VD大鼠模型復制和評價的方法，因研究目的不同，略去神經行為學評價部分）。造模結束后，將實驗大鼠隨機分為模型組、給藥組。造模24h后，各組動物灌胃給藥，空白組和模型組給予蒸餾水，給藥組給予天珠散超微粉625mg/kg（按體質量法計算有效劑量），連續給藥60d。

2.2全基因組芯片檢測

2.2.1樣品制備：各組分別隨機選取3只大鼠，取海馬組織液氮保存。以Trizol法抽提組織總RNA，并純化RNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。由純化的總RNA合成雙鏈cDNA，純化，片段化cDNA，熒光標記。

2.2.2雜交和洗滌：將片段化的cDNA和其他對照試劑混合，制備成雜交液。將雜交液注入芯片中，在雜交爐中雜交16h。從雜交爐中取出芯片，加入洗脫液和染色液，在全自動洗脫染色工作站中完成洗脫和染色。

2.2.3熒光掃描：芯片結果采用掃描儀進行掃描，讀取信號。

2.2.4數據預處理與分析：將信號值進行預處理，包括數據過濾，將信號值進行以2為底取對數轉換，數據歸一化。采用SBCAnalysisSystem系統進行一維方差分析（OnewayANOVA），計算模型組和給藥組差異表達的顯著性強度。計算模型組與給藥組差異表達信號強度的比值，比值＞2為表達顯著上調基因，比值＜0.5為表達顯著下調基因。

3.基于中藥語法系統（directedTCMgrammarsystems，dTGS）的靶點關系網絡構建實體語法系統（entitygrammarsystems，EGS）是針對生物復雜系統建模所建立的一種形式語法系統[14]。由于其靈活的特點，EGS已經應用于化工過程中調控流圖模型的構建[15]，中藥作用機理的闡釋[16]。EGS構建的詳細描述見參考文獻[15]，在此僅作簡要敘述。EGS用G表示，由5個基本元素組成，G=（VN,VT,F,P,S），其中VN∪VT=V，VN表示非末端字符集，VT表示末端字符集，VN∩VT=Φ，F表示基本元素之間的結構關系，P代表由已知實體產生新實體的推理規則，S表示系統初始狀態，即推理的起點。

3.1dTGS原理dTGS和EGS具有相同的結構：集合V包括不同的節點類型（差異表達基因、蛋白質、疾病相關靶點等），集合F包含網絡中不同的節點關系類型，集合P包含的規則用于節點間關系的推斷，描述如下。①V=V1∪V2∪V3∪V4，其中，V1為差異基因表達的蛋白質集合，V2為疾病相關靶點集合，V3為背景網絡中的其它蛋白質集合，V4為背景網絡中的非蛋白質分子集合。link（X,Y,Z,W）定義為節點X（如蛋白質）作用于節點Y（如蛋白質），作用方式為Z（正向或負向），作用距離為W，若W為1，則表明節點X作用于節點Y只經過了一步反應。在本研究中in（X）標記為差異基因表達的蛋白質，out（Y）標記為疾病相關蛋白質，totalnet（X,Y,Z,W）即表示為以X為起點，Y為終點的多條通路，作用方式為Z，作用距離為W，每一條通路中的W值可以為不同的整數值。minnet（X,Y,Z,W）中的W表示為以X為起點，Y為終點的所有信號通路中作用距離最短的一條通路的步長。P1表示以in（A）為起點推導出的link（A,B,X,Y），標記的link（A,B,X,Y）定義為totalnet（A,B,X,Y）。P2∪P3∪P4∪P5為規則集，通過這4個規則推導網絡中標記的蛋白質對下游蛋白質的最終作用方式和距離。規則P2表示如果A對B的作用是正向，B對C的方向是正向，則A對C的作用方式是正向的。同時，如果A作用于B的需要D步反應，B作用于C經過E步反應，則A作用于C的距離為D＋E。同樣的定義規則P3，P4和P5。如果起始蛋白對疾病靶點間的通路有多條時可以用規則P6辨識出作用距離最短的一條通路。在規則P6中，如果totalnet（A,B,C,X）中的B為疾病相關靶點（即終點），那么#min{D:totalnet（A,B,_,D）}=X表示從A到B的最短距離為X。在網絡構建過程中，由起點推導到最后的疾病靶點可能需要使用多次上述規則。④S=S1∪S2，其中，S1表示在背景網絡中用于推理的具有link（X,Y,Z,W）結構的實體集合。S2為標記的蛋白質，表示為in（X）和out（Y）。

3.2數據來源差異基因表達的蛋白質來源于GeneCards數據庫。VD疾病相關靶點蛋白數據來源于SciClips數據庫。以生物學反應及信號通路數據建立的背景網絡來源于Reactome數據庫。將得到的結果minnet（A,B,C,X），利用軟件Cytoscape實現網絡的可視化。

二、結果

1.天珠散樣品的紅外光譜鑒別天珠散中的天麻收錄在《中華人民共和國藥典》中并有質量控制標準[17]，但是延齡草尚未收錄在《中華人民共和國藥典》中，缺少相應標準。天珠散在土家族民間為打粉服用，且有效成分不明確，無法采用定量數據進行質量控制，因此，文章采用FTIR對其進行定性鑒別。天珠散及其組方中延玲草、天麻的紅外光譜圖見圖1，3種樣品的紅外光譜均具有很高的相似度，相似系數都在0.96以上。在4000-1300cm-1波數范圍的官能團區有幾個明顯的特征峰，分別為3390、2929、1736、1655、1515、1415和1371cm-1。文章選擇了10個主要的吸收峰進行對比，不同樣品各個吸收峰的詳細對照表見表1。在選擇的10個主要吸收峰的對比中可以明顯地看到，峰的吻合性很好，最大波數差異為5，根據譜圖中特征峰的變化規律，可以鑒別各單味藥對復方配伍的整體貢獻，該研究方法能夠準確快速鑒別復方及各組方藥物，在缺乏質量控制標準的情況下實現對天珠散進行質量控制的目的。

2.海馬組織全基因組芯片檢測給藥組與模型組的全基因組芯片檢測結果比較，得到差異表達基因229條，其中上調基因（>2）219條，下調基因（<0.5）10條，說明天珠散是通過調控上述基因發揮抗VD的作用。

3.差異基因表達蛋白作用于VD靶點的生物網絡以Reactome數據庫中的生物學反應及信號通路數據為背景網絡構建差異基因表達蛋白作用于VD靶點的生物網絡，見圖2。圖中較大的圓形節點代表疾病相關靶點，較小的圓形節點代表差異表達基因，六邊形節點代表差異基因表達的蛋白質及通路中涉及的蛋白質，平行四邊形節點代表復合物，方形節點代表小分子，三角形代表不同的生物反應。其中帶有三角形箭頭的邊代表正向調節作用，T形箭頭的邊代表負向調節作用，無向邊代表作用方向不確定。該網絡可從分子水平整體展示差異基因表達蛋白的抗VD作用機制。由圖2可知，差異基因凝血因子V（coagulationfoctorV，F5）、Cyp11b3、Cyp2d6、Ins1和Ins2表達的蛋白經過多步生化反應影響VD相關靶點：內皮型一氧化氮合酶（NOS3）、胰島素（INS）和血清載脂蛋白A1（APOA1）。差異基因Aoc3的表達蛋白-血管黏附蛋白-1（vascularadhesionprotein1，VAP-1）直接為VD相關的靶點。由于納入網絡中的差異基因要求在十步反應內就要作用于疾病靶點，而且有些基因表達的蛋白與背景網絡中其它生物分子間的聯系還沒有相關研究，甚至部分基因的表達蛋白目前還不明確，導致網絡中涉及的差異基因相對較少，雖然基因表達發生變化但并未體現在網絡中。相信隨著對基因、基因表達蛋白和疾病相關關系研究的深入，基于EGS構建的網絡將能夠更清晰完整地闡釋天珠散抗VD的作用機制。僅從該網絡我們仍可得出天珠散影響多個基因的表達，通過多條通路作用于多個疾病相關靶點起到抗VD的作用。

圖2中6個差異表達基因通過多條生物途徑作用于4個VD靶點，表明天珠散是通過多途徑、多靶點發揮抗VD的作用，同時也說明生物網絡的穩健性、冗余性等特征。我們可以提取出每一條子網絡來清晰展示差異表達基因和VD相關靶點間的生物網絡。限于篇幅，文章僅從圖2提取出兩條子網絡作為示例，圖3為F5作用于NOS3的通路，圖4為Cyp11b3作用于INS的通路。F5基因編碼生成的輔因子（FA5）是凝血級聯反應中一個重要的因子，為促凝性非酶輔因子。單鏈F5在凝血酶作用下通過修飾生成具有促凝輔助活性的雙聚體FVa，在鈣離子存在的條件下，FVa和FXa在磷脂膜表面上形成FVa-FXa復合物，增強FVa使凝血酶原轉變成凝血酶的能力。目前，發現有4個蛋白酶激活受體（PAR），其中3個為凝血酶受體，人體內幾乎所有細胞都有不同類型的PARS存在與表達，其生理功能非常廣泛，包括誘發凝血反應、促進細胞分裂與增殖、釋放炎性介質等。激活PAR能刺激胞漿磷脂酶、蛋白激酶、絲裂原蛋白活化激酶等的各種反應，促進細胞生長。在天珠散的影響下，給藥組F5基因表達量為模型組的0.4452，導致下游的反應減少，凝血作用降低，同時產生的能量降低，促使脂肪酸β氧化加速。VanOM等的研究證實，凝血因子升高與AD和VD的發病危險增加有關，其中與VaD的相關性更強，有效控制這一因素可預防認知障礙。

Paralemmin-1（PALM）結合輔酶A生成PALM-CoA，PALM在大腦中表達量最高，它影響質膜動力學，細胞形成，調節偽足、神經元突觸的形成、樹突棘的成熟，最終影響神經系統的發育和適應性。同時，異常的NOS3基因表達使其產生的NO與超氧自由基反應，生成毒性作用更強的氧自由基，破壞神經元脂質蛋白及核酸，還能通過對神經元內線粒體呼吸功能的抑制，損傷呼吸鏈，最終造成神經細胞死亡。目前研究發現，慢性腦缺血導致腦組織損傷的機制主要有細胞凋亡、免疫反應、氧化應激及缺血后神經遞質的改變等，目前的觀點也認為，NO幾乎參與了所有的損傷途徑。NOS3主要存在于血管內皮細胞，可抑制血管內皮表面血小板和白細胞的黏附、聚集，抑制血管平滑肌細胞增生，產生肌肉舒張、血管擴張和血流量增加的作用，對腦卒中、高血壓病引起的血管內皮功能異常具有治療作用。綜上，F5基因主要通過降低凝血作用，同時改變神經元間的接觸點及突觸，影響作為神經遞質和信使分子的NO，最后在氧化應激、免疫反應、細胞凋亡及缺血后神經遞質改變方面發揮抗VD的藥理作用。Cyp11b3基因生成的蛋白Cyp11b3屬于細胞色素P450家族，是一類以血紅素為輔基的B族細胞色素。目前，超過50%的藥物代謝經由細胞色素P450氧化，在藥物代謝和解毒方面有重要意義。細胞色素P450與NOS一樣，都是以硫醇鹽結合血紅素為活性中心催化氧原子轉移的氧化還原酶。Cyp11b3作為一種末端加氧酶，將傳遞所得電子轉移給TPN，TPN為氧化型輔酶2，經過氧化還原反應參與生成2-氧戊二酸鹽（2OG）和谷氨酸（Glu），Glu的釋放依賴于Ca2+，在Ca2+存在時，動作電位達到神經突觸前膜末梢后，突觸囊泡與突觸結合，通過胞吐作用將Glu釋放到突觸間隙，作為興奮性神經遞質參與信息傳遞。在腦組織缺血早期，由于腦缺血過度激活Glu受體，導致細胞內Ca2+超載、自由基數目增加、細胞內的線粒體損傷，出現神經元和膠質細胞的快速死亡。胰島β細胞分泌INS是由胰島素分泌顆粒局部Ca2+濃度的迅速升高而觸發的，不同時相下的胰島素分泌或胰島素的不同階段可能由不同來源的Ca2+觸發或增強，兩者相互協調，在胰島素分泌中起重要作用[33]。Hassing等[34]通過對702例80歲以上老年VD患者的研究發現：2型糖尿病患者患VD的可能性是非糖尿病患者的3倍。該信號通路也展示了糖尿病作為VD的重要致病因素的部分機制。綜上，Cyp11b3表達的蛋白質通過影響神經遞質Glu和第二信使Ca2+發揮抗VD的作用。

三、討論

本研究共得到差異表達基因229條，其中上調基因（>2）219條，下調基因（<0.5）10條；通過對大鼠海馬組織全基因組芯片檢測結果中上調、下調基因及差異基因表達蛋白作用于VD靶點的生物網絡分析，得出天珠散主要通過3條途徑發揮抗VD的作用：①調節與認知功能有關的突觸損傷；②通過調節血管內皮凝血因子、血管黏附蛋白及NOS3，影響缺血性腦血管內皮細胞的生長及其炎性反應；③影響中樞神經系統中起神經遞質和第二信使作用的Glu、NO和Ca2+。結果表明天珠散是通過調控多個基因的表達，影響多條生物途徑、作用于多個靶點發揮抗VD的作用。中藥方劑作用于生物體，導致體內基因表達發生變化，差異基因表達蛋白將通過一系列的生化反應影響到疾病相關靶點。本研究從中藥方劑和治療對象這兩個整體出發，并且沿中藥方劑-差異基因-差異基因表達蛋白-疾病相關靶點這個完整的生物學過程，系統研究天珠散抗VD的分子機制。雖然基因表達發生變化并不一定說明蛋白表達產生變化，但是存在著很大的可能性，而且生物通路中上游的微小變化將對下游產生極大影響。綜上，相比于傳統研究方法，本文采用系統藥理學的思想和方法，能從分子水平上更快速、更系統地闡明中藥方劑作用機制，對于中藥方劑功效預測、合理利用以及疾病生物標志物的選擇具有一定的指導作用。關于本思路合理性的驗證還需要進一步實驗的支持。

本研究的結果是根據現有數據庫中收錄的數據進行的推斷，部分基因的表達蛋白還有待補充，所以結果仍具有一定的局限性。為了找到與抗VD相關性較大的作用機制，本文生物反應步數限制在10步以內，所以，納入網絡的差異基因及疾病靶點數量相對較少。相信隨著對基因表達蛋白、人類生物學反應和信號通路的進一步研究，該方法利用的數據將更加完善，所得結果也將更加準確和完整。由于生物系統具有動態演變及個體差異的特點，我們仍需要建立能夠量化的數學模型來模擬復雜系統的大量功能各異的分子在非線性相互作用下產生的功能和行為。因而闡明和定量預測中藥作用機制仍需要實驗和計算研究的整合，這也將是我們今后研究的重要方向。

作者：張百霞 宋闊魁 李彥文 張燕玲 李志勇 王耘 單位：北京中醫藥大學中藥學院 中央民族大學少數民族傳統醫學研究院 中國中醫科學院中醫藥信息研究所