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1原子力顯微鏡簡介

最初的AFM是在一個彈性懸臂上固定一個尖端極細的探針在樣品表面掃描。探針針尖上的原子與樣本表面的原子之間存在一定的斥力，掃描時針尖隨樣本表面的高低起伏變化，使懸臂隨之上下起伏，用一束激光照到懸臂上，其上下起伏可由激光束的變化反射到接收裝置中，經計算機處理后形成樣品表面的三維形貌圖。根據針尖與樣本的接觸情況，AFM有兩種掃描模式：接觸模式與輕敲模式，前者指針尖在掃描過程中始終與樣品接觸，后者則是利用懸臂的高頻震動使針尖間斷地與樣品接觸。AFM的成像原理使它具有其他顯微技術所不具備的優點：1)分辨率高；2)觀察的樣品范圍很廣；3)制樣簡單；4)可在液態環境中觀察；5)成像時間短，可得到物體表面的三維形貌圖。在醫學診斷中，AFM能夠觀察到細胞膜原子量級的變化，這對于疑難病例的進一步診斷與研究，可以起到很大的輔助作用，在人體的各個系統中，相關學科研究者先后應用原子力顯微鏡進行了大量的觀察分析。

2原子力顯微鏡在醫學中的應用

2.1心血管系統

早期，LalR對于心臟的縫隙連接，DomkeJ對單個心肌細胞的機械脈沖這些心肌細胞間的微細結構都進行了觀察。Davies等，Miyazaki等較早利用AFM對兔腹主動脈內皮細胞的觀察，在一個側面反映了內皮細胞的相關特性。而Sato等[3]應用AFM測量靜息培養及剪切應力作用下的牛主動脈內皮細胞的局部力學特征。近年來，Wildling等[4]應用AFM測量培養的人類對血管內皮細胞EA.hy926表面和醛固酮化的AFM針尖之間的剪切力和粘附性，得出結論是血管內皮細胞膜表面存在醛固酮受體。而Jacot等[5]的研究中關注了基板僵硬在心肌細胞成熟中的影響。發現，心外膜的彈性模量自胚胎期的(12±4)kPa到新生兒期的(39±7)kPa。這種變化從一定程度上說明了顯著影響新生兒心肌發展的因素。

2.2消化系統

雖然掃描電鏡和透射電鏡可以顯示完整的細胞骨架及孔的輪廓，但是AFM卻可以對肝內皮細胞竇孔進行觀察，AFM可顯示竇孔為抬高的嵴，間接反映出管性細胞骨架[6]。Braet等[7]用AFM觀察到肝臟的自然殺傷細胞(NK細胞)和CC531s大腸癌細胞在共同培養基中相互結合后，CC531s大腸癌細胞的數量減少，這為臨床治療提供了思路，可以嘗試導入NK細胞來殺傷癌細胞。

2.3呼吸系統

在氣體交換過程中，肺泡表面活性物質(TM)可以調節肺泡的表面張力，從而保持肺結構的穩定性。TM由40nm×40nm的正方形拉長的蛋白質脂蛋白組成，早在1999年Nag等[8]就應用AFM聯合TEM對TM進行了研究。侯淑蓮等利用AFM對產生了TM的特殊三維結構進行了觀察。

2.4神經系統

Annalisa等較早的利用AFM比較了人的正常神經細胞和神經腫瘤細胞表面的形態結構，并觀察到了神經元突起，Ohshiro等[9]將神經軸突和RBL間的信息傳遞在AFM上進行了成像。應用力學方面，使用彈性常數為0.03N/m的微懸臂，當諧振頻率為30kHz時，對多種活細胞如大鼠海馬神經元細胞、星形膠質細胞等進行了成像研究，在細胞培養液中可獲得高分辨的活細胞表面形貌信息[10-11]。劉智良等[12]在實驗中，利用AFM觀察和測定到了紅藻氨酸作用后海馬神經元胞膜表面超微結構明顯變化。刑仕歌等研究發現一定濃度的Ach可損傷神經細胞膜，降低細胞存活率，損傷程度有時間和劑量依賴性。陳勇等對培養的PC12神經元細胞從形態學方面探究，應用AFM可以觀察到其凋亡小體的膜表面發生了明顯的變化。對于不同來源的神經干細胞，周虎田等[13]應用原子力顯微鏡觀測到細胞表面形貌結構的異同：更深入揭示了不同來源的神經干細胞增殖、分化差異的機制。Cecchi等[14]利用AFM在接觸模式下，就人類SH-SY5Y神經母細胞瘤中ADDLs對膜脂質過量和膽固醇含量的依賴性進行了調查研究。

2.5血液系統

使用AFM對人外周血淋巴細胞活化48h內的形態學變化進行的研究[15]表明：淋巴細胞在受刺激后形貌發生明顯變化，同時細胞表面超微結構也趨復雜，出現免疫突觸。劉美莉等[16]利用AFM和SNOM分別進行了觀察，發現淋巴細胞表面分布著凹凸不平的顆粒狀結構，可以更深入的了解免疫信號的傳遞、淋巴細胞的活化、闡明免疫過程的作用機制。蔡小芳[17]通過AFM力曲線的分析發現正常淋巴細胞和Jurkat細胞的力學性能有著明顯區別。說明原子力顯微鏡以其分子力譜的優勢可能可以應用于臨床區分正常細胞和腫瘤細胞。胡怡等[18]利用原子力顯微鏡從可視化的角度觀察人血小板與Ⅰ型膠原膜相互作用后受激活化過程中的形態學變化。

2.6泌尿生殖系統

利用AFM觀測膀胱癌病人BIU-87活細胞的超微結構，顯示了單個癌細胞的動態變化，細胞間的連接，通過胞膜伸出的突觸。之后又對人膀胱癌細胞株T24活細胞進行了動態成像觀察。

2.7眼科

用AFM研究正常兔角膜內皮細胞，獲得了內皮細胞表面及覆蓋于表面的糖鏈圖像，并將戊二醛固定標本的結晶與剛摘除的新鮮標本的結晶相比較，同時用唾液酸酐酶及透明質酸酶處理樣品后還獲取了糖鏈組成的信息。實驗證明：透明質酸酶處理的標本較唾液酸酐酶處理標本細胞表面及形態變化較少，更接近于固定的未處理的內皮細胞真實形態。

2.8口腔科

AFM在牙科生物材料的研究中具有廣泛的應用價值。Hegedus等[21]對牙釉質表面進行侵蝕方面的觀察實驗。Marshall[22]，Wennerberg等[23]用AFM成像觀察了Carisolv處理齲齒前后表面的變化，肯定了Carisolv的治療價值。Arzate等較早利用AFM觀察比較了人的牙骨質癌細胞和造骨細胞不同的形貌特征；李鑫輝等將原子力顯微技術引入到口腔腫瘤病理學的研究中。除了獲得高分辨率的癌細胞內部超微結構成像之外，還對樣品表面進行了局部操縱。

2.9腫瘤細胞的觀察

應用AFM觀察腫瘤細胞，利用所測得的形貌圖和相圖將觀察到的腫瘤細胞和正常細胞進行比較，可以直觀的獲得細胞的異同，為探究腫瘤疾病的病因及發生機制開辟了新途徑。早期，Ehrenhoefer等對MDCK細胞、WuHW等對L929細胞、Goldmann等對F9細胞、Rotsch等[24]對腺癌細胞的觀察，發現各類細胞的細胞膜表面均有高度不等的“突起”和“凹陷”；不同種類的細胞“突起”和“凹陷”不同，表現出明顯的差異。陳勇等[25]對培養的人胃癌SGC7901、人肝癌HepG2、人肺癌細胞AF2TC2A21、人乳腺癌MCF272R和人肺腺癌A549細胞經藥物作用后，進行細胞膜表面超微結構的觀察，對于相關腫瘤細胞的特性有了更直觀的了解。近期，Kaul-Ghanekar等[26]發現相對與正常相臨近的組織切片，SMAR1表達減低的人類乳腺癌組織切片的表面粗糙度增高。王希濤等[27]應用AFM觀察了S100A8/A9處理后的人宮頸癌上皮細胞癌細胞系CasKi細胞，細胞形貌發生卷曲，皺縮，細胞膜下的骨架結構比較模糊，排列紊亂，網絡狀的結構遭到了破壞，細胞間連接和偽足減少。從而證實了S100A8/A9蛋白復合物對細胞骨架的影響是通過改變F-肌動蛋白的解聚和重排發生作用的。

3展望

AFM在醫學應用中，制約因素主要有：首先，細胞純度的提取，單細胞的獲得。由于在各個器官組織中存在多種細胞，而且取得的玻片標本中，細胞厚度均勻不一，無法清楚的獲得AFM掃描圖像，甚至無法順利進行掃描，而培養的細胞和原生的細胞存在很大差異。其次，普遍研究的是經過溶液固定的細胞和組織，以至于處理后的細胞活性大大降低，因此主要的研究熱點轉為利用AFM在生理條件下對新鮮組織和活性的細胞進行高分辨成像。但是，能夠在生理條件下，使用AFM對活體生物樣本進行高分辨成像的細胞種類還不多，成像質量也有待提高。所以，探索一個更適合的單細胞取材方法，開發在生理狀態下對活性細胞的探測手段，擴展原子力顯微鏡的觀察范圍，將為AFM在各學科中的應用開辟更大的空間。