本站小編為你精心準備了蛋白質芯片技術在醫學中的作用參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

1蛋白質芯片的分類

蛋白質芯片又稱蛋白質微陣列(proteinmicroarray),根據構建方法和用途的不同,可將蛋白質微陣列分為分析型陣列、功能型陣列和反相陣列3類[2]。分析型陣列主要用于測定蛋白質的表達水平、結合特異性及特定蛋白質之間的結合親和力等;而功能型陣列包含全序列功能蛋白質或蛋白質結合域,主要用于研究復雜的分子間作用,如蛋白質與蛋白質/DNA/磷脂/小分子間的相互作用等;反相陣列與分析型陣列類似,用點樣儀將組織細胞的裂解液以陣列排布于硝酸纖維素膜載體,與特定抗體反應后,利用化學發光法等分析得到裂解液中的抗原信息。也有根據分子間相互作用原理,將蛋白質微陣列分為抗原-抗體陣列、受體-配體陣列和酶-底物陣列等。

2蛋白質芯片制備技術

2.1載體選擇蛋白質芯片的載體主要包括載玻片,膜類載體(硝酸纖維素膜、PVDF膜、尼龍膜、聚苯乙烯等)和復合材料載體。載玻片耐高溫處理,可高離子強度洗滌,背景信號低且價格低廉,在基因芯片和蛋白質芯片中被廣泛使用。膜類載體是傳統蛋白質分析方法westernblotting(免疫印跡)常用的軟基質,但其作為芯片載體具有難以克服的缺點:首先,膜類物質表面非特異性吸附作用強,較高的背景信號會大幅降低信噪比;其次,點樣物質在膜表面容易擴散不利于形成高濃度蛋白質樣點;第三,膜類載體通常不能進行高密度蛋白質點樣[3]。本實驗室研究發現,選擇合適的封閉液可有效地減少非特異性吸附,降低背景信號;維持適當的膜表面濕度,可改善點樣物質的擴散問題;膜類載體點樣密度雖不及載玻片,但可用于構建應用型檢測芯片。本實驗室構建的同時檢測多病原蛋白質芯片,結果可直接用肉眼判定,應用前景廣闊。另外,近年來出現的復合載體芯片,結合了多種載體的優點。如Lee等[4]利用金包被的硅片載體成功構建了單分子蛋白質納米芯片,用于分析單分子間的作用。最近有報道將硝酸纖維素膜等覆于載玻片表面構建三維芯片,如Chatterjee等[5]利用硝酸纖維素膜涂層的載玻片構建蛋白質芯片,取得良好效果。三維芯片載體相對二維載玻片具有更強的蛋白質吸附能力,表面的凝膠或纖維素可更有效地維持蛋白質分子三維結構,降低蛋白質分子變性。

2.2芯片點印芯片載體點印前一般需經過洗滌、特定溶液浸泡等預處理,從而保證點樣后的蛋白質活性。蛋白質芯片點制多采用最初設計用來制作基因芯片的接觸式和噴墨式點樣設備。由于蛋白質芯片的靶分子一般是具有多級結構的蛋白質分子,有別于基因芯片中線性的核酸分子,所以點制時一般不用基因芯片采用的原位合成法構建。最近蛋白質芯片在構建方法方面也有新突破。如Tao等[6]借助體外翻譯,探索出2種簡便的蛋白質芯片構建方法:一種是借助固相載玻片表面固定的寡核苷酸鏈接嘌呤霉素,快速插入合成中的核糖體氨基端,使新合成的蛋白質肽鏈被固定于載玻片表面,從而構建蛋白質芯片;另一種是將幾種蛋白質的DNA合成模板經體外轉錄得到mRNA-DNA雜交鏈點印于載玻片,經體外翻譯、RNase處理等步驟,構建蛋白質芯片。相應的測試結果顯示這兩種方法均具有較好的可操作性,并能克服現有芯片制作方法的部分缺陷。Chatterjee等[5]則借鑒比較成熟的DNA芯片技術,將質粒DNA點印于載玻片表面,利用質粒可高親和力結合新合成蛋白質的特點構建蛋白質芯片。

3蛋白質芯片信號檢測技術

根據被檢測樣品液是否需要前處理,可將蛋白質芯片的信號檢測分為直接檢測和間接檢測兩大類。

3.1直接檢測直接檢測法常用的有表面等離子共振技術(surfaceplasmonresonance,SPR),滾環擴增技術(rollingcir-clesamplification,RCA),表面增強激光解吸離子化-飛行時間質譜法(surfaceenhancedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry,SELDI-TOF-MS)[7]等。SPR傳感器芯片的金膜表面固定有探針分子,當樣品液流過金膜時,特定蛋白質與探針分子結合引起傳感器芯片表面共振角的改變,通過分析傳感圖譜的變化,便可獲取探針分子與樣品中特定蛋白質分子相互作用信息。Koga等[8]利用SPR技術,實時連續測定了細胞裂解液中400種抗體分子的表達情況。通過對SPR信號的連續繪圖發現,當蛋白質芯片表面抗體量在50~1000pg時,SPR傳感器芯片檢測限可低至5μg/ml。RCA系統是一種可放大反應信號的新分析方法,可用于檢測核酸分子或抗原抗體間的特異性反應。SELDI-TOF-MS同時結合了色譜和質譜技術,主要用于微量蛋白質的檢測。特定蛋白質與芯片表面探針分子結合,經激光激發為氣化肽離子后,因其飛行時間與多肽離子的質量/電荷比成反比,故可根據肽離子從飛行時間質量分析儀一端飛抵另一端探測器所需時間,分析比對得到檢測結果。Semmes等[9]將蛋白質芯片與SELDI-TOF-MS技術結合,用于評估依據血清蛋白質修飾早期診斷前列腺癌的篩查體系。SELDI-TOF-MS法可快速、大量的分析微量蛋白質,其缺點是只能分析蛋白質的分子量,不能確定空間構象。

3.2間接檢測間接檢測法將被檢測物用熒光染料、親合素、化學發光劑、放射性同位素等標記,通過檢測標記信號的強弱、分布等間接推斷樣品信息。熒光染料標記可兼容基因芯片信號掃描儀器,安全有效,應用廣泛。Haab等[10]利用熒光物質雙標記被測溶液,結果顯示其構建的抗原/抗體微陣列的檢測限分別可達1.0ng/ml和0.1ng/ml。Colca等[11]利用光親和標記研究惡唑烷酮類(oxazolidinones)的作用機制,顯著簡化了噻唑啉二酮類敏化胰島素作用靶點的篩選過程。Mitsopoulos等[12]介紹了多種化學標記方法在基因組學和蛋白質組學研究中的應用。同位素標記法與熒光染料標記類似,在蛋白質芯片標記中也有較多應用。最近有研究報道將納米級磁性微粒、金顆粒等作為標記物,結合芯片技術檢測抗原。為探索幾種病毒的目視檢測法,LeBlanc等[13]將生物素化的病毒寡核苷酸序列固定于陣列表面,利用能與生物素特異結合的鏈親合素包被磁性微珠放大檢測信號,檢測結果可用肉眼、普通光學顯微鏡判斷。Chu等[14]利用膠體金標記第二抗體,結合銀染顯色,實現對抗原抗體復合物的目視檢測。基于雙抗體夾心法,本實驗室選用連接有馬來酰亞胺的納米級金顆粒標記第二抗體,配合銀染顯色,結果可用肉眼直接判定,進一步以掃描儀獲取信號,并進行灰度分析,便可實現對特定病原體的半定量檢測。可視化芯片對昂貴儀器的低依賴度,檢測結果用肉眼判斷,很可能成為芯片技術的研究熱點。直接檢測法可同時測定的蛋白質含量通常較低,對特殊儀器有較高依賴性,應用較局限。間接檢測法操作簡單,結果易分析,使用前景遠大于直接檢測法。但其在數據可信度方面仍待提高,標記分子、被標記蛋白質間連接效率不穩定使信號與檢測物換算困難,需盡量除去標記后游離的標記物及蛋白質分子,保證被標記的蛋白質分子占足夠比例,以排除游離蛋白質對檢測的干擾。

4蛋白質芯片在醫學診斷領域的應用

蛋白質芯片是一種大規模、高通量的分析技術,它可在單次實驗中快速、簡便、平行分析數以千計的蛋白質分子,早期主要用于蛋白質組學研究,隨后逐漸推廣到醫學相關領域。近年來,蛋白質芯片結合基礎醫學和臨床醫學,在疾病發生機制、診斷學、新藥發現等方面有新的突破。Lin等[15]將幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)與十二指腸潰瘍(DU)的發病機制關聯,將新發現的幽門螺桿菌3個潛在性與DU相關的抗原固定于蛋白質陣列,建立了快速、便捷鑒定DU患者血清抗體類型的方法。Felgner等[16]將含有1205種假鼻疽伯克霍爾德桿菌(Burkholderiapseudomallei)的蛋白質微陣列與類鼻疽病人血清反應,分析得到170種潛在抗原蛋白質。進一步以這些潛在抗原構建微陣列,并與不同地區的類鼻疽病人、其他感染類型病人及健康人群的血清反應,最終獲得49種類鼻疽特異性抗原及59種可與所有人群血清反應的交叉反應抗原。利用蛋白質微陣列診斷類鼻疽的敏感性和特異性分別高達95%和83%。Song等[17]利用可解離抗體微陣列染色(DAMA)技術,分析正常乳腺細胞和乳腺癌細胞中312種蛋白質的表達修飾,發現5種在乳腺癌細胞中顯著高表達的蛋白質,為乳腺癌診斷提供了新的標志物。為監測SARS(severeacuterespiratorysyndrome)的感染,Zhu等[18]構建了冠狀病毒蛋白質微陣列,用健康人血清驗證該方法檢測冠狀病毒感染的準確性、特異性和敏感性均大于90%。用于測定自身抗體的蛋白質與抗原分子微陣列技術也已獲得初步應用[19-20]。可見,芯片技術可高通量平行分析的特點使傳統分析方法不能實現的高通量數據分析成為可能。蛋白質芯片對高親和性、高特異性抗體的要求,某種程度上也推動相關領域的共同發展。

5展望

蛋白質芯片技術具有高通量、快速、微量樣品消耗等優點,是最高效的樣品分析方法之一,但現階段該技術的發展和應用仍面臨很多問題。第一,具有多級結構的蛋白質分子,活性易受溫度、pH、有機溶劑等因素的影響,當條件控制不當時,易使芯片表面的蛋白質分子活性減弱甚至完全喪失。第二,蛋白質芯片靶分子捕獲目標分子的反應條件較之基因芯片更為苛刻,優化反應條件以保證檢測質量的過程,是一項耗時費力的工作。第三,讀取信號常用的激光掃描儀價格昂貴,使用面窄,限制了芯片技術的普及。第四,蛋白質芯片技術沒有類似于PCR的擴增技術,也不存在蛋白質測序技術,無法短期內大量獲取高純度的目的蛋白質,推廣受限。本實驗室開發的目視化測定蛋白質芯片,點樣密度雖不及傳統芯片,但其具有信號可目測和對昂貴儀器低依賴性的優勢,很可能為蛋白質芯片技術開辟一條新的發展道路。