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作者：楊強(qiáng)，彭江綜述盧世璧，袁玫

【關(guān)鍵詞】軟骨

隨著材料科學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、力學(xué)生物學(xué)以及生物反應(yīng)器技術(shù)的進(jìn)步，采用組織工程的方法構(gòu)建合適形狀和大小的組織工程骨軟骨復(fù)合體為骨軟骨復(fù)合缺損的修復(fù)提供了新的希望。本文將對(duì)這一領(lǐng)域進(jìn)行綜述。

1支架

目前關(guān)于組織工程骨軟骨體支架材料的設(shè)計(jì)原則有很大差異，主要分為以下4類：

1.1僅采用骨支架，軟骨部分不采用支架

即直接將高密度的軟骨細(xì)胞或成軟骨細(xì)胞直接種植到骨支架上方，在體外培養(yǎng)或者植入體內(nèi)修復(fù)骨軟骨復(fù)合缺損。Wang［1］等將高密度的豬原代軟骨細(xì)胞分別種植到3種支架材料P(L)LA、P(D，L)LA、膠原／羥基磷灰石(Col-HA)復(fù)合支架材料上，在體外用閉合的靜態(tài)生物反應(yīng)器培養(yǎng)7周后，構(gòu)建出的骨軟骨復(fù)合體的軟骨部分富含Ⅱ型膠原和糖胺多糖(GAG)，軟骨部分與骨支架材料結(jié)合良好。Waldman［2］等同樣將牛軟骨細(xì)胞高密度種植到聚磷酸鈣(calciumpolyphosphate，CPP)支架上，體外成功培養(yǎng)出骨軟骨復(fù)合體。Kandel［3］等用相同方法構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合體，體外培養(yǎng)8周以后植入到羊股骨髁間窩遠(yuǎn)端的骨軟骨缺損，組織工程骨軟骨復(fù)合體與周圍的骨軟骨床愈合良好，并且其生物力學(xué)性能有了很大的提高。

TULI［4］采用人骨髓來(lái)源的間充質(zhì)祖細(xì)胞，誘導(dǎo)成軟骨后在離心管中做成高密度的細(xì)胞片，然后將PLA支架壓于其上，然后將誘導(dǎo)成骨的細(xì)胞種植到PLA支架中，組織學(xué)結(jié)果表明生成了軟骨樣組織和骨樣組織，骨、軟骨結(jié)合部界面跟正常骨、軟骨結(jié)合部類似。

1.2骨與軟骨部分分別采用適合骨、軟骨構(gòu)建的不同的支架材料，然后在體外培養(yǎng)或者手術(shù)植入時(shí)組裝成一體化雙層支架

分別培養(yǎng)組織工程骨、軟骨，然后用粘合劑粘合、縫合或者順序植入等方法將組織工程骨、軟骨部分組裝成組織工程骨軟骨復(fù)合體。Kreklau［5］等報(bào)道將軟骨細(xì)胞／纖維蛋白懸液滴加到聚乙交酯(PGA)和左旋聚丙交酯(PLLA)共聚物支架，置于天然珊瑚(Biocoral)或人工合成的碳酸鈣材料(Calcite)上，并用纖維蛋白膠和凝血酶粘合固定，用灌注式生物反應(yīng)器體外培養(yǎng)成雙層骨軟骨復(fù)合物，組織學(xué)檢查見(jiàn)軟骨部分有基質(zhì)分泌，骨、軟骨界面結(jié)合良好。GAO［6］等利用鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞分別向成骨與成軟骨誘導(dǎo)分化以后分別種植到多孔陶瓷材料和透明質(zhì)烷衍生物(HYAFF-11)材料，兩者之間的界面用纖維蛋白粘合，植入裸鼠皮下培養(yǎng)，生成組織工程骨軟骨復(fù)合體，但是生成的軟骨組織為纖維軟骨。

Schaefer［7］等將牛的軟骨細(xì)胞接種到PGA非編織纖維網(wǎng)狀支架，將骨膜成骨細(xì)胞接種到聚丙交酯聚乙交酯共聚物(PLGA)和聚乙二醇(PEG)的混合物支架，分別培養(yǎng)組織工程骨、軟骨，然后用縫線縫合的方法成功構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合體。李旭升［8］等也采用無(wú)創(chuàng)傷線縫合的方法組裝分別培養(yǎng)的組織工程骨、軟骨部分，構(gòu)建出骨軟骨復(fù)合體，但是構(gòu)建的骨、軟骨部分之間有大量纖維組織，沒(méi)有解決骨軟骨構(gòu)件間分層的問(wèn)題。Schaefer［9］等用將兔異體軟骨細(xì)胞種植在PGA支架上，體外培養(yǎng)4～6周以后，與Collagraft(一種骨替代材料，含HA)縫合后構(gòu)建成骨軟骨復(fù)合組織，成功修復(fù)了兔股骨髁間窩(非負(fù)重區(qū))骨軟骨缺損，但是組織工程軟骨部分與周圍宿主軟骨整合欠佳。

GAO［10］等采用順序植入可注射鈣磷復(fù)合物以及透明質(zhì)烷(UA)海棉的方法修復(fù)了兔膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)骨軟骨缺損。ShaomI等將骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)分別種植到三維多孔的聚己酸內(nèi)酯(PCL)支架以及磷酸三鈣加強(qiáng)的聚己酸內(nèi)酯(TCP、PCL)支架上，順序植入兔股骨髁負(fù)重區(qū)骨軟骨缺損，組織學(xué)結(jié)果顯示成功的修復(fù)了骨軟骨缺損，生物力學(xué)評(píng)估表明6個(gè)月時(shí)組織：工程軟骨的楊氏模量接近正常軟骨的水平。

1.3骨軟骨部分采用相同的支架材料構(gòu)建的單層支架

Cao［12］等利用熔融沉積技術(shù)(FDM)用多孔聚已酸內(nèi)酯(PCL)材料制造出多孔蜂窩狀的支架材料，分為兩部分，分別種植成骨誘導(dǎo)的入骨髓基質(zhì)細(xì)胞和人肋軟骨細(xì)胞，掃描電鏡結(jié)果表明骨、軟骨部分有不同的基質(zhì)分泌。Alhadlaq［13～15］等將鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分別向成軟骨與成骨方向誘導(dǎo)分化，然后用聚乙二醇(PEG)水凝膠懸液包裹，順序倒入具有人顳下頜關(guān)節(jié)突形狀的模具中，在裸鼠皮下成功培養(yǎng)4周后組織學(xué)觀察到分層的軟骨樣和骨樣組織。

1.4骨軟骨部分采用不同的支架材料構(gòu)建的一體化的雙層支架

直接構(gòu)建骨軟骨部分結(jié)合良好的一體化雙層支架，這種支架的優(yōu)點(diǎn)是：(1)骨、軟骨支架部分結(jié)構(gòu)不同，分別適合骨、軟骨生長(zhǎng)的不同要求；(2)骨、軟骨部分結(jié)合良好，解決了在體外培養(yǎng)或者植入體內(nèi)時(shí)骨、軟骨分層的問(wèn)題。這種一體化的組織工程骨軟骨復(fù)合支架，可能是以后發(fā)展的方向。

ChangCH［16］利用明膠和煅燒骨制備了

骨、軟骨支架部分結(jié)合良好的新型骨軟骨雙層支架，作為軟骨組織支架的明膠部分滲透到作為骨支架的煅燒骨中，達(dá)到良好的結(jié)合。將豬軟骨細(xì)胞接種到明膠支架部分，放在特別設(shè)計(jì)的雙腔生物反應(yīng)器中培養(yǎng)2周或者4周，組織學(xué)檢查表明骨軟骨復(fù)合體的軟骨部分為透明軟骨病且有陷窩形成。HungCT［17～19］等用松質(zhì)骨和包裹軟骨細(xì)胞的瓊脂糖凝膠體外培養(yǎng)構(gòu)建出骨軟骨復(fù)合體。Tanaka［20］等用膠原凝膠覆蓋在多孔的D-TCP構(gòu)建雙層支架，在膠原凝膠中種植軟骨細(xì)胞部分修復(fù)了兔關(guān)節(jié)骨軟骨缺損。這幾項(xiàng)研究的共同點(diǎn)就是采用凝膠作為軟骨支架，利用凝膠能滲入到多孔骨支架材料的特性，構(gòu)建出的骨軟骨復(fù)合組織不易分層，構(gòu)建出結(jié)合良好的組織工程骨軟骨復(fù)合體。

Sherwood［21］等利用三維打印技術(shù)(TheriFormTM)制造出的新型骨—軟骨三維支架，體外成功培養(yǎng)出組織工程骨軟骨復(fù)合物。支架的軟骨部分采用D，LPLGA／LPLA材料，孔隙率為90％，孔徑為106～150μm；骨部分采用LPLGA／TCP材料，孔隙率為55％，孔徑為125～150μm。特別新穎的是在骨、軟骨支架交界區(qū)組成成分含量、氣孔率等方面形成梯度變化，這樣可以避免支架在體外培養(yǎng)和體內(nèi)植入時(shí)發(fā)生界面分層，有利于新生的骨與軟骨組織之間形成良好界面；并且骨支架部分設(shè)計(jì)成苜蓿葉形狀，體內(nèi)植入時(shí)增加了支架材料與周圍骨質(zhì)的接觸面積，增強(qiáng)了抗扭轉(zhuǎn)應(yīng)力。解放軍總醫(yī)院骨科研究所張東［22］等將兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)以后種植在一體化不同孔隙率的雙層PLGA支架材料上構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合體，成功的修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨缺損。

2種子細(xì)胞

關(guān)于種子細(xì)胞的接種類型具體分為以下4類：

2.1只接種用于軟骨構(gòu)建的種子細(xì)胞

在修復(fù)骨軟骨缺損時(shí)，由于骨髓中含有大量的骨源性細(xì)胞，因此組織工程骨軟骨復(fù)合體可以只接種用于軟骨組織構(gòu)建的種子細(xì)胞。Wang［1］waldman［2］Sherwood［21］等僅用軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞在體外構(gòu)建了骨軟骨復(fù)合體，或用于體內(nèi)骨軟骨缺損的修復(fù)。但是軟骨細(xì)胞本身為成熟細(xì)胞，增殖能力較低，并且存在去分化現(xiàn)象，分泌基質(zhì)能力降低，并且在實(shí)際臨床應(yīng)用中存在來(lái)源有限、多次手術(shù)的問(wèn)題［23］，可向軟骨分化的干細(xì)胞如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞或者脂肪干細(xì)胞［24］是一種較好的選擇。

2.2骨軟骨部分分別接種用于骨、軟骨構(gòu)建的組織細(xì)胞

Schaefer［7］等采用軟骨細(xì)胞和骨膜細(xì)胞，Cao［12］等用人肋軟骨細(xì)胞和人骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，Schek［25，26］等采用豬的原代軟骨細(xì)胞與腺病毒轉(zhuǎn)染BMP7基因的人成纖維細(xì)胞為種子細(xì)胞在體外成功構(gòu)建出骨軟骨復(fù)合體。

2.3接種可誘導(dǎo)成骨與軟骨的干細(xì)胞

Tuli［4］等用人骨髓來(lái)源的間充質(zhì)組細(xì)胞分別向軟骨和骨方向誘導(dǎo)，成功構(gòu)建出骨軟骨復(fù)合體。采用單一的多能干細(xì)胞作為種子細(xì)胞輔以誘導(dǎo)成骨、成軟骨，并在支架材料上誘導(dǎo)骨軟骨復(fù)合組織形成的方法，雖然調(diào)控過(guò)程復(fù)雜，但是其過(guò)程類似于體內(nèi)骨軟骨發(fā)育過(guò)程，故可能是以后發(fā)展的方向。

2.4單純支架材料，不接種種子細(xì)胞

Fukuda［27］等利用羥基磷灰石(HA)噴涂的超高分子量聚乙烯纖維制造的三維支架，用I型膠原和FGF-2浸漬后，用于修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)髁間窩的骨軟骨缺損，48周后有透明軟骨樣組織和新的軟骨下骨生成。可見(jiàn)，即使不接種細(xì)胞，在支架材料中結(jié)合生長(zhǎng)因子也可用于骨軟骨缺損的修復(fù)。

3生物反應(yīng)器技術(shù)在骨軟骨復(fù)合體培養(yǎng)中的應(yīng)用

生物反應(yīng)器在組織工程中的研究主要包括：(1)在三維支架上均勻種植種子細(xì)胞；(2)促進(jìn)組織工程產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)；(3)模擬體內(nèi)力學(xué)環(huán)境施加一定力學(xué)刺激；(4)通過(guò)自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化控制組織工程產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程，降低生產(chǎn)成本，大規(guī)模生產(chǎn)。

Chang［16］等創(chuàng)新性設(shè)計(jì)了專門用于骨軟骨復(fù)合物共同培養(yǎng)的雙腔攪拌灌注式生物反應(yīng)器，具有2個(gè)腔，中間用硅膠膜隔開(kāi)，骨軟骨復(fù)合支架放置在硅膠膜的孔中，通過(guò)磁棒的攪動(dòng)和培養(yǎng)基的灌注增加營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，不同的種子細(xì)胞(如軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞)可以在硅膠膜隔開(kāi)的骨軟骨支架中以不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并且可將多能干細(xì)胞接種到骨軟骨支架后在生物反應(yīng)器的2個(gè)腔中分別向成骨、成軟骨兩個(gè)方向誘導(dǎo)。Kreklau［5］研制的灌注式生物反應(yīng)器也成功地培養(yǎng)出了骨軟骨復(fù)合組織。

4組織工程化全關(guān)節(jié)或半關(guān)節(jié)的構(gòu)建進(jìn)展

利用組織工程的方法構(gòu)建大面積的組織工程化骨軟骨復(fù)合體甚至一個(gè)組織工程化半關(guān)節(jié)或者全關(guān)節(jié)，也是一個(gè)重要的研究方向。

Isogai［28］等將預(yù)制成遠(yuǎn)節(jié)、中節(jié)指骨外形的PGA和PLLA共聚物用骨膜包裹構(gòu)建中、遠(yuǎn)節(jié)指骨，呈關(guān)節(jié)軟骨外形的PGA材料接種軟骨細(xì)胞后培養(yǎng)形成軟骨，PGA接種腱細(xì)胞培養(yǎng)形成關(guān)節(jié)囊，采用縫合方法將各配件組裝起來(lái)形成中、遠(yuǎn)節(jié)指骨與遠(yuǎn)側(cè)指間關(guān)節(jié)并植入裸鼠皮下，觀察到具有指骨和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)外形的骨、軟骨、關(guān)節(jié)囊形成，證明了培養(yǎng)人體小關(guān)節(jié)的可行性。Alhadlaq［13～15］等研制出具有顳下頜關(guān)節(jié)突形狀和大小的組織工程化骨軟骨復(fù)合體。Glowacki［29］和Feinberg［29］亦提出采用組織工程骨、軟骨、關(guān)節(jié)盤構(gòu)建復(fù)雜的顳下頜關(guān)節(jié)的設(shè)想。Schek［25,26］等利用圖像輔助設(shè)計(jì)IBD(imagebaseddesign)技術(shù)和SFF(solidfreeform)固態(tài)自由成型技術(shù)制造出了具有顳下頜關(guān)節(jié)(TMJ)外形的的生物仿生支架，其優(yōu)點(diǎn)是能夠根據(jù)個(gè)體化病人的損傷生產(chǎn)出與關(guān)節(jié)面幾何形狀相匹配的支架，并且能同時(shí)控制支架的微結(jié)構(gòu)。Hung［18，19］等采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(CAD)和制造技術(shù)制造出的骨軟骨復(fù)合組織，軟骨面面積達(dá)11.7cm2，平均厚度達(dá)3.4mm，是迄今為止體外構(gòu)建最大的具有關(guān)節(jié)面外形的骨軟骨復(fù)合組織。

5存在問(wèn)題

盡管組織工程骨軟骨復(fù)合物和組織工程化關(guān)節(jié)的研究取得了很大進(jìn)展，但研究中也暴露出一些

問(wèn)題：(1)無(wú)論在體外或體內(nèi)，構(gòu)建組織的骨、軟骨界面結(jié)合欠佳；(2)形成的骨與軟骨組織的質(zhì)量缺陷，透明軟骨比例少，缺乏正常關(guān)節(jié)軟骨的分層結(jié)構(gòu)，部分工程化軟骨缺乏表淺的扁平細(xì)胞層和潮標(biāo)等；(3)構(gòu)建的骨軟骨復(fù)合組織的軟骨部分面積受限，機(jī)械性能較差，還不能滿足承重的要求，并且能否長(zhǎng)期持續(xù)存在尚待進(jìn)一步研究證實(shí)，只是短期觀察表明在形態(tài)學(xué)、生化成分等方面具有軟骨組織結(jié)構(gòu)；(4)組織工程軟骨與周圍宿主軟骨整合欠佳。

6展望

構(gòu)建功能性的組織工程骨軟骨復(fù)合物對(duì)作者來(lái)說(shuō)是非常大的挑戰(zhàn)，以下幾個(gè)方面將是努力的方向：(1)種子細(xì)胞，采用單一的多能干細(xì)胞作為種子細(xì)胞輔以誘導(dǎo)成骨、成軟骨；(2)支架材料，采用第三代生物支架材料，即在控制支架的微結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，研究如何在支架材料中結(jié)合生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子更好的促使細(xì)胞增殖、分化、成熟，研究如何使骨、軟骨支架材料更好的結(jié)合以避免分層，研究如何采用圖像輔助設(shè)計(jì)(1BD)技術(shù)和先進(jìn)制造技術(shù)制造與關(guān)節(jié)缺損甚至全關(guān)節(jié)形狀、大小一致的支架；(3)生物反應(yīng)器技術(shù)的應(yīng)用，研制適合組織工程骨軟骨復(fù)合物培養(yǎng)的生物反應(yīng)器。采用功能組織工程學(xué)(Functionaltissueengineering)的方法，模擬體內(nèi)生化環(huán)境和力學(xué)環(huán)境，利用生物反應(yīng)器對(duì)組織工程化組織施加一定的力學(xué)刺激，以提高骨軟骨復(fù)合物的生物力學(xué)性能，達(dá)到植入體內(nèi)負(fù)重的要求。

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