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作者：孔靈玲，王學春，崔文，王旭，楊慶媛，宋希元，姜曉剛，燕春艷

【摘要】目的：探討基質金屬蛋白酶MMP9與宮頸鱗癌的發生、發展及轉移的關系.方法：免疫組化SP法測定MMP9的表達及分布；明膠酶譜法測定活性型MMP9蛋白的含量；RTPCR技術檢測MMP9mRNA表達水平.結果：在宮頸鱗狀上皮癌(SCC)組織和高度鱗狀上皮內損害(HSIL)中MMP9蛋白的表達量均高于低度鱗狀上皮內損害(LSIL)(P<0.05)；宮頸SCC組織中淋巴結轉移組MMP9的陽性率為78.3%,高于無淋巴結轉移組63.3%(P<0.01)；MMP9的表達在不同的病理分級與臨床分期之間差異無統計學意義.而SCC和HSIL中的MMP9酶活性均高于LSIL(P<0.01).而SCC和HSIL中的MMP9mRNA的表達情況亦與上述結果相似.結論：MMP9與宮頸SCC的早期浸潤及轉移有關，MMP9表達量的增高，尤其是其酶活性的增高有助于正確評估患者預后和制定適當的臨床治療方案.

【關鍵詞】宮頸腫瘤;鱗狀細胞癌;金屬蛋白酶類;腫瘤轉移

0引言

宮頸癌發病率高，從低度鱗狀上皮內損害(lowgradesquamousintraepitheliallesions,LSIL)到高度鱗狀上皮內損害(highgradesquamousintraepitheliallesions，HSIL)和原位癌(carcinomasinsitu)，然后到鱗狀上皮癌(squamouscellcarcinomas，SCC)是一個連續的過程.我們研究基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)在宮頸癌的發生和發展過程中所起作用.

1材料和方法

1.1材料宮頸癌活檢組織84例取自我院199901/200212宮頸癌患者，年齡25~68歲.按國際婦產科聯盟(FIGO)1994年修訂的臨床分期標準，LSIL(CINI)10例，HSIL(CINII,III)21例，宮頸鱗癌53例.在宮頸鱗癌中I期14例，II期39例；高分化11例，中分化17例，低分化25例；淋巴結轉移23例.手術時取腫瘤組織、癌旁組織、手術切緣及周圍淋巴結.抗MMP9羊抗人多克隆抗體及SP免疫組化試劑盒（北京中山生物制劑公司）；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺和明膠（美國Sigma公司）；Trizol試劑盒（美國GibcoBRL公司）；引物由上海生工生物工程公司合成.

1.2方法

1.2.1組織MMP9表達免疫組化及結果判定采用免疫組織化學鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物酶法(SP法).一抗的工作濃度為1∶100；陰性對照組以PBS代替一抗.每個病例均同時做HE染色和MMP9免疫組化.結果判定參考文獻［1］,以胞質或(和)胞膜出現棕黃色顆粒沉著為陽性表達.先按染色強度打分：無色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；再按陽性細胞所占百分比打分：陽性細胞<5％為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75％為4分.將染色程度和陽性細胞百分比的乘積進行評分：0～4分為(－)，5～8分為弱陽性(+)，9～12分為強陽性().

1.2.2組織MMP9活性分析標本于液氮下粉碎、勻漿、離心，取上清液以Centricon濃縮柱按體積比離心濃縮6倍，BioRad蛋白定量試劑盒定量、分裝.取20μL上清液進行聚丙烯酰胺(SDS)凝膠電泳，濃縮膠濃度50g/LpH6.8，分離膠濃度100g/LpH8.8.電泳后，凝膠于50mmol/LTrisHCl（pH7.0）,5mmol/LCaCl2,100mmol/LNaCl,25mL/LTritonX100中浸泡振搖1h，中間換液1次，不含TritonX100的洗液洗5min后，再用50mmol/LTrisHCl（pH7.5）,5mmol/LCaCl2,200mmol/LNaCl,0.2g/LNaN3,10mL/LTritonX100的孵育液37℃條件下孵育18～24h，考馬斯亮藍R250染色，脫色，干燥封膠.通過凝膠圖像吸光度分析系統對結果進行灰度掃描，以平均吸光度（INT）和雜交信號面積（S）的乘積代表信號強度.

1.2.3MMP9mRNA的表達按Trizol試劑盒說明提取組織總RNA，取上述RNA樣品1.5μg進行逆轉錄反應，反應體系為20μL，反應條件為37℃1h，95℃5min.取產物5μL進行PCR擴增，MMP9與內參照基因βactin的引物共管擴增.MMP9的引物序列為5′GGTCCCCCCACTGCTGGCCCTTCTACGGCC3′及5′GTCCTCAGGGCACTGCAGGATGTCATAGGT3′.βactin引物序列為5′CCGAATTCATCATGTTTGAGACCTTCAA3′及5′CCGGATCCATCTCTTGCTCGAAGTCCA3′.MMP9及βactin預計擴增片段分別為638bp及326bp.PCR參數為94℃30s，55℃30s，72℃30s.30個循環后，72℃延伸5min.通過凝膠圖像光密度分析系統對PCR產物電泳條帶進行灰度掃描，以INT和S的乘積代表信號強度，計算MMP9與βactin灰度值的比值作為MMP9mRNA的相對表達量.

統計學處理:采用SPSS13.0軟件分析系統進行非參數檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義.

2結果

2.1MMP9的免疫組化測定MMP9在HSIL中的陽性率為4新晨