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1實驗目的

1)了解發酵過程與雙極膜電滲析集成的基本理論。2)熟悉發酵罐與雙極膜電滲析的基本操作。3)研究發酵過程與雙極膜電滲析集成操作的最佳條件。

2實驗原理

在發酵生產乳酸的過程中，乳酸的不斷產生會造成發酵液的pH不斷下降。pH過低會影響發酵液中乳酸菌種的活性，甚至造成乳酸菌種死亡，直接影響發酵過程的效率。傳統的乳酸提取工藝如圖1左圖所示，是在發酵液中投加生石灰或碳酸鈣來中和產生的乳酸，以維持發酵液的pH在中性范圍。由于發酵液中加入的生石灰或碳酸鈣會產生大量難以有效處理的硫酸鈣副產物，不符合現代化學工業綠色化和環境化的理念。乳酸發酵的現代生產工藝流程見圖1右圖，整個工藝流程包含了發酵、脫色、超濾、雙極膜電滲析等過程。結合上述工藝流程，實驗室相應開設出乳酸發酵實驗、發酵液預處理———超濾和脫色實驗、乳酸鹽轉化為乳酸———雙極膜電滲析實驗以及發酵過程與雙極膜電滲析集成操作實驗。本文重點介紹將發酵過程與雙極膜電滲析進行集成操作的實驗內容。對經過預處理的(脫色和超濾后的)發酵液進行雙極膜電滲析，得到乳酸;同時將雙極膜電滲析產生的堿用于發酵過程的pH調節。從而實現了在提取回收乳酸產品的同時，又能進行乳酸的發酵生產。實驗中的乳酸發酵和雙極膜電滲析是一個集成過程，而不是連續操作的過程。雙極膜電滲析的原理如圖2所示。圖2中的雙極膜電滲析是用雙極膜代替普通電滲析的部分陰、陽膜或者在普通電滲析的陰、陽膜之間加上雙極膜構成的。雙極膜電滲析的最基本應用是在反向偏向電壓下產生水解離生成H+和OH－，分別與鹽陰離子(X－)、鹽陽離子(M+)結合生產酸(HX)和堿(MOH)。從而在集成操作的過程中，實現了在將乳酸鹽轉化為乳酸的同時，可以生成堿液(乳酸鹽為MX，可以產生堿液MOH)。在提取乳酸的同時，將副產物(堿液MOH)返回至發酵過程，對發酵液進行pH調節，使副產物得到再次利用，從而實現了新型化工生產追求的過程集成性和高效性，并減少了原料或產品的周轉過程。

3實驗材料、儀器和試劑

3．1實驗試劑乳酸發酵菌種:植物乳桿菌;發酵液500mL;電極室用水:0．3mol/L的Na2SO4溶液1000mL(陰極室和陽極室各500mL);酸室和堿室為蒸餾水。發酵培養基每升含:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、葡萄糖50g、乙酸鈉2g、檸檬酸二胺2g、吐溫-801g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0．2g、一水硫酸錳0．05g。

3．2實驗儀器恒溫振蕩器、高壓蒸汽滅菌鍋、發酵罐、干燥箱、電子天平、pH計、生物傳感分析儀、分光光度計、冰柜。其他常規實驗器皿:燒杯、量筒、玻璃棒、酒精燈、接種環、培養皿、移液管等。直流穩壓電源;明道式電滲析膜堆一套，外配容量為1000mL的燒杯5只，硅膠管(約0．5m)10根;小型潛水泵5個。按照圖3，通過發酵罐控制主機箱上的蠕動泵，將雙極膜電滲析的堿液隔室與發酵罐進行連接。為了降低發酵罐中染雜菌的風險，必須對連接的管子進行滅菌操作。發酵罐內由pH計進行實時監測，當pH低于設定值時，由蠕動泵自動將雙極膜電滲析的堿液隔室中的堿液泵入發酵罐進行調節。由于軟管內是強堿環境，故堿液室與發酵罐之間的連接管不需要進行滅菌操作。

4實驗步驟

4．1雙極膜電滲析的準備(1)組裝膜堆:按“陽極板—隔板—雙極膜—隔板—陰膜—隔板—陽膜—隔板—雙極膜—陰極板”順序組裝膜堆，用長螺桿釘壓緊膜堆。為了確保裝置的嚴密性，應使隔板之間的墊圈厚度不超過墊圈槽，并使雙極膜的陽膜側朝向陰極板。此外，在用螺釘壓緊裝置時，應注意均勻用力，以防止裝置變形甚至斷裂。(2)連接外圍設備:在隔板出口分別連接出水管和進水管。將進水管與外置燒杯中的潛水泵出口連接，將出水管的出口端連接到燒杯中，以確保循環通路暢通。(3)注入料液和電極水:在鹽室中注入料液，在極室中注入電極水，在酸室和堿室中注入蒸餾水，此過程應保證料液淹沒潛水泵。對于雙極膜電滲析，應在實驗結束后將各個隔室、燒杯和潛水泵內的料液或電解質溶液清洗干凈。若長期不用，應將裝置拆卸還原，并確保各組件干燥和清潔。

4．2發酵過程的準備(1)種子培養基的培養:配制一定量的種子培養基，并在高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌。滅菌條件為:121℃，20min。待培養基冷卻至室溫后，取新鮮斜面菌種，接入種子培養基中，在轉速為150r/min的搖床中培養24h，溫度恒定在37℃。(2)發酵罐滅菌:將配制好的發酵培養基加入到發酵罐中，此處應注意體積不能超過發酵罐總體積的2/3。然后將發酵罐和培養基一起放入滅菌鍋中進行滅菌。(3)火焰接種法:先用醫用酒精擦拭接種口;在火圈中加入酒精，點燃后套在接種口上;關小空氣進氣閥，調節進風，降低罐壓，打開接種口蓋;在火焰范圍內打開種子培養基的瓶塞，在火焰上燒灼幾秒鐘后，迅速將種子液倒入發酵罐中;在火焰上燒灼接種口蓋子數秒后，迅速蓋好接種口蓋，關閉空氣進氣閥。(4)發酵培養:接種結束后，對發酵培養過程的各項參數進行設定，開始培養。發酵過程中要打開冷凝器水閥。具體操作參數:轉速為150r/min;溫度為37℃;pH為6．7。

4．3發酵罐與雙極膜電滲析集成操作過程的監測在集成操作過程中，要對發酵罐和雙極膜電滲析同時進行監測，防止任一方出現問題導致集成操作失敗。發酵過程:①通過發酵罐的主機控制發酵的pH條件、溶氧濃度和實驗溫度。每1h記錄pH、溫度和溶氧濃度，通過數據判斷發酵過程是否正常;②每4h測量殘余葡萄糖的量、生物量和乳酸的生成量，以判斷細菌的生長情況和乳酸的生成情況。雙極膜電滲析過程:①雙極膜電滲析過程調整穩壓電源的電壓和電流值來控制實驗條件，每1h記錄電壓、電流。②每4h測量酸室中的乳酸濃度、堿室濃度和堿室堿液體積。

5分析方法

5．1葡萄糖和乳酸的測量在發酵過程中，要間斷地取樣進行監測。發酵液中含有有機酸鹽、無機鹽、菌絲體、蛋白質、脂肪和糖類等。雙極膜電滲析過程的料液是經過超濾和脫色之后的發酵液，主要成分為有機酸鹽(主要為乳酸鹽)和無機鹽類物質。實驗中使用生物傳感分析儀獲得葡萄糖和乳酸含量。

5．2生物量的測量在發酵過程中，要及時監測乳酸菌的生長情況。取樣后，用0．3mol/L的稀鹽酸溶液稀釋，目的是消除一些沉淀性鹽的影響。在波長為600nm處，測量吸光度。

6實驗注意事項

(1)發酵實驗結束后，需要完成乳酸發酵液的初步提取工作。應及時向發酵罐中加入NaHCO3，使pH升高到10左右。同時升高溫度至90℃，使菌體和其他懸浮物下沉。發酵原液澄清后，將上清液收集到塑料桶中，放入冰柜中保存并用于下一步的提純。對澄清后的沉淀物集中進行處理。(2)在利用發酵罐控制主機進行發酵液pH調節時，要控制堿液的添加速度，以使堿液與發酵液充分混合反應，并確保發酵液的pH不被調節得過高而影響微生物生長。(3)如果裝置發生泄漏，應盡快壓緊裝置;如果情況得不到改善，應拆卸裝置、查找原因(或更換墊圈、或增加墊圈厚度等)。在實驗完畢后，應將隔室、燒杯和潛水泵內的料液或電解質溶液清洗干凈。若長期不用，應拆卸還原裝置，并確保各組件干燥和清潔。7結語本文介紹的發酵過程與雙極膜電滲析的集成操作實驗體現了化學工程學科發展的新方向。從實驗教學的角度來講，教師將適合的科研內容向實驗教學內容進行轉化，可使實驗內容與學科前沿同步，做到科研與教學密切聯合，相互促進;從實驗教學的效果來看，通過在2012年夏季實驗課程中的開展，有助于豐富學生知識結構，培養原創思想，提高科研素質;更重要的是能使學生改變傳統的化學工程反應觀念，激發對新型化學工程學科的學習興趣。根據兩年來的教學實踐，我們認為發酵過程與雙極膜電滲析的集成操作是一個值得推廣的化學工程實驗。

作者：馮紅艷徐銅文王曉林楊偉華單位：中國科學技術大學化學實驗教學中心