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關鍵詞：流行性腦脊髓膜炎；腦膜炎奈瑟菌；實驗室技術

流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦）是由腦膜炎奈瑟菌（Nm）通過呼吸道傳播引起的化膿性腦膜炎，為急性呼吸道傳染病，常在冬春季引起發病與流行。腦膜炎發病迅速，病死率超過20％，且后遺癥嚴重［1］。我國90％以上的患者是由A群Nm引起。Nm是只存在于人體的需氧雙球菌，其外膜含脂多糖成分，致病性Nm的外膜外有莢膜多糖。Nm有多基因差異。根據Nm莢膜多糖的不同，分為12個血清群：A、B、C、H、I、K、L、X、Y、Z、29E、W135和不能分群菌株。Nm的病原學檢測包括細菌培養、革蘭染色、生化鑒定、血清學分群，乳膠凝集反應直接檢測抗原等。腦脊液革蘭染色仍是快速檢測Nm的重要方法之一，患者淤點（斑）、腦脊液涂片檢測時在中性粒細胞內見到革蘭陰性腎形雙球菌或腦脊液、血液培養Nm陽性或腦脊液、血液Nm特異性核酸片段檢測陽性都可作為流腦的確診依據。病原學檢測是檢驗Nm的傳統方法，但因Nm對冷、熱、干燥和化學消毒劑的高度敏感性和對外環境的弱抵抗力，以及臨床標本的采集、運送、培養、接種方式、培養基質量、檢測人員的經驗等都可能影響檢驗結果的準確性。PCR分子學診斷的優點是可測出菌群特異性NmDNA，不要求陽性結果中存在活的病原體，且結果可在2h內獲得［2］。目前，高敏感性、高特異性、操作簡便的分子生物學檢驗技術已廣泛應用于Nm感染的檢驗診斷。本文就Nm的檢測技術及檢測進展作初步綜述。

1Nm的病原學檢測技術

病原學檢測是最早應用于細菌檢測的方法。分離出Nm是診斷流腦的“金標準”，其鑒定方法包括革蘭染色、氧化酶試驗、生化鑒定、血清學分群等。基于獲得的陽性菌株，可進行進一步的研究，比如體外藥物敏感試驗就必須首先分離到陽性菌株。李馬超等［3］就曾對其實驗室2005－2006年分離的49株Nm菌株（16株A群、33株C群）進行體外抗菌藥物敏感性檢測，結果表明，16株A群Nm菌株對復方磺胺甲噁唑、四環素、左氧氟沙星、萘啶酸4種抗菌藥物耐藥，對環丙沙星耐藥或中度敏感，33株C群Nm菌株對復方磺胺甲噁唑耐藥，31株（93．9％）C群菌株對萘啶酸耐藥，20株（60．6％）C群菌株對左氧氟沙星耐藥，17株（51．5％）C群菌株對環丙沙星耐藥，4株A群和1株C群Nm菌對青霉素不敏感。馮君平等［4］進一步探索了A群、C群Nm的最適培養基，結果表明添加酵母浸出粉的培養基可作為A群、C群Nm培養的最適培養基。鄭春早等［5］配制了一種小牛血清“雙抗”培養基作為Nm的增菌培養基，與常規檢測培養基比較表明，應用小牛血清“雙抗”培養基建立的新方法適用于A、B、C群Nm的檢測，且檢測效果明顯優于常規的咽拭子直接接種法。病原學檢測的缺點是比較繁瑣、耗時、影響因素多，特異性可能不夠好。

2Nm的普通聚合酶鏈反應（PCR）

PCR是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，對于不能用血清學分群的Nm疑似菌株或無法進行Nm分離培養的腦脊液、血液、血清標本可采用PCR進行DNA擴增輔助檢測鑒定。近年來PCR技術廣泛應用于Nm的檢測中［2，6］。黃亮等［7］采用普通PCR技術對流腦疑似病例的腦脊液和血液標本中Nm種屬及各群的特異性DNA片段進行了檢測，發現6例流腦疑似患者的腦脊液標本中有5份Nm屬特異性基因CrgA陽性，5份檢出NmC群SiaD（C）基因片段；血液標本中1份檢出NmCrgA基因，1份檢出NmC群SiaD（C）基因片段。張文艷等［8］對Nm血紅素加氧酶的基因Hemo進行擴增，結果表明，Nm標準菌株為陽性結果，即擴增出長為424bp的DNA片段，而肺炎鏈球菌、乙型流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌均未擴增出該DNA片段，為陰性結果；PCR技術能檢測出4pg的腦膜炎雙球菌DNA，具有高敏感性；11份腦脊液樣品NmPCR檢測常規培養檢測結果顯示，PCR檢出率為36．3％，而培養法的檢出率為18．2％，PCR明顯高于培養法（P＜0．05）。徐麗等［9］則利用普通PCR技術建立了檢測29E群、X群和Z群等3個血清群Nm的方法，然后將該方法應用于41份疑似Nm菌株標本的檢測，結果表明，41份疑似Nm標本中，29E群和X群PCR陽性的標本分別有7份和2份，未檢測出Z群菌株，建立了能準確、特異地鑒定29E群、X群和Z群Nm菌株的PCR方法。

3Nm的多重（復合）聚合酶鏈反應（PCR）

普通PCR主要用于單一致病因子的鑒定；多重PCR反應原理與一般PCR相同，主要用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定，也可用于某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。近年來，多重PCR技術越來越廣泛應用于Nm的檢測。任紅宇等［10］針對包括Nm在內的8種細菌的特異性基因，通過優化單一PCR擴增體系及擴增程序，初步建立了能同時檢測8種導致細菌性腦膜炎的病原體的復合PCR擴增方法。熊長輝等［11］應用多重PCR技術對其實驗室保存的70株已經血清學鑒定的Nm進行核酸鑒定及基因分群，同時檢測23例流腦疑似病例腦脊液標本中Nm特異性DNA片段，發現68株Nm的多重PCR檢測結果與血清學分群結果一致，2株血清學未能分群的Nm經多重PCR檢測為C群；23例流腦疑似病例腦脊液標本經多重PCR檢測有5例為C群，1例為A群，1例為B群，陽性檢出率為30．43％，傳統的病原分離培養、生化鑒定和血清學鑒定4例為C群，陽性檢出率為17．39％。可見多重PCR技術對Nm檢測的特異性優于病原學檢測。DIAWARA等［12］應用復合熒光實時PCR（RT－PCR）技術對腦脊液中的Nm和肺炎鏈球菌進行了檢測，結果表明，Nm和肺炎鏈球菌的不同熔融溫度的兩峰分別為87．5℃、85．5℃。Nm和肺炎鏈球菌的RT－PCR的靈敏度分別為100％（95％CI：82．4～100．0，85．1～100．0），二者特異度相同，均為100％（95％CI：88．6～100．0）。Nm和肺炎鏈球菌引起的腦膜炎的診斷準確率分別提高到50．7％和28．6％。DEFILIPPIS等［13］利用多重PCR技術對Nm、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌進行了檢測，總共收集了110個分離株和134例臨床標本（99例腦脊液和35例血液標本）并進行了分析，結果表明，所使用的方法快速、特異性好、靈敏度高。ZHU等［14］利用多重PCR技術對Nm進行了基因分型。結果表明，其檢測靈敏度為1ng基因組DNA（相當于4×105基因組），腦脊液標本中為3×105cfu／mL，這種多重PCR檢測可能有助于臨床診斷和流腦流行病學監測。

4熒光定量PCR檢測Nm法

熒光定量PCR通過熒光染料或熒光標記的特異性探針對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，通過相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始水平。雷永良等［15］應用該技術對167例流腦監測標本進行了檢測，并與傳統的病原學檢測進行比較，結果表明新方法與傳統方法陽性符合率為55．56％，另有4例傳統方法檢測為陰性的標本用熒光定量PCR檢測為陽性，其特異度、靈敏度都高于傳統培養法，且檢測周期更短。楊艷等［16］針對Nm特異性基因porA設計引物、探針，用實時熒光PCR技術進行檢測，并與常規PCR比較，結果表明應用實時熒光PCR檢測時，64株Nm檢測結果均為陽性，6株非Nm結果均為陰性。檢測靈敏度達5．0×103cfu／mL，即5cfu／test，比常規PCR靈敏度高10倍，并且結果重復性好。張曉春等［17］采用熒光定量PCR檢測健康者咽拭子中Nm的帶菌情況，結果表明，熒光定量PCR的靈敏度、特異度均為100％，陽性預測值（PPV）為13．09％，陰性預測值（NPV）為100．00％，檢出限為0．5cfu／50μL體系，熒光定量PCR檢出結果的時間為3h，而培養法至少要2d。該方法可用于疾病的快速診斷，特別適合健康者的帶菌率調查。MIRONOV等［18］采用熒光定量PCR技術對Nm參考菌株和187例腦膜炎患者的腦脊液進行研究，結果表明該方法比傳統培養法有更好的特異性和敏感性。文獻［12］也將熒光定量PCR技術與多重PCR技術結合，取得了良好的實驗結果。

5酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測Nm抗體水平

應用ELISA間接法檢測患者急性期和恢復期血清中的抗體水平，如恢復期效價較急性期呈4倍或4倍以上升高，可作為流腦的輔助鑒別。ELISA間接法也可以應用于健康者血清抗體的測定，結果可為當地的流腦防控提供參考。張洪飛等［19］應用ELISA分析了通遼市科左中旗221例健康者Nm帶菌情況及其抗體水平，檢出腦膜炎雙球菌13株，總帶菌率為3．81％；A群抗體陽性率為71．91％，C群抗體陽性率為47．51％，為該地區今后的流腦預防、控制提供了科學依據。

6Nm的分子分型及其他新技術

多位點序列分型（MLST）技術是從基因水平通過管家基因的點突變對Nm進行分型，利用MLST可以對數十年前不同地區分離的菌株之間的親緣關系進行評估，尤其是對不同菌群之間基因發生的頻繁的重組事件，分析菌株進化關系及判斷分離株是否屬高致病性克隆系等方面，可彌補傳統血清型分型方法的不足［20］。MLST適合用于長期的、大范圍的流行病學調查和監測菌群結構變化，研究地域性傳播和流行性變遷。兩株細菌MLST分型結果相同，表示這兩株細菌屬于相同的克隆或者克隆群，不能認為他們之間有流行病學聯系。朱水榮等［20］采用MLST技術，對浙江省2004－2013年部分Nm菌株開展基因分型研究，得出了浙江省Nm分離株間的遺傳進化關系，為今后有針對性地制訂流腦預防控制措施提供參考。鄧小玲等［21］則采用MLST技術，對廣東省Nm分離株間的遺傳進化關系進行了研究，為有針對性地采取預防控制措施提供依據。脈沖場凝膠電泳（PFGE）是一種分離大分子DNA的方法，實踐表明，大于40kb的DNA不能在恒強水平瓊脂糖凝膠電泳中分離，PFGE解決了這一難題。PFGE可以用來分離相對分子質量10kb到10Mb的DNA分子。其分型的基礎是大片段的插入、缺失、重組或質粒的獲得、丟失或酶切位點的點突變。MOODLEY等［22］應用PFGE技術對南非2002－2006年B群Nm克隆分析，發現了一個新的基因克隆ST－4240／6688。邵祝軍等［23］則應用PFGE技術對中國C群Nm分離株進行分析，結果發現AH1是中國C群Nm主要的帶型。在流腦調查中，上述兩種分子分型的運用原則：暴發調查時所有菌株進行PFGE，挑選代表菌株進行MLST，對于流腦特異性引物PCR擴增陽性的患者血清或者腦脊液未能分離到菌株的進行MLST；個案調查時所有菌株進行PFGE和MLST分型，對于流腦特異性引物PCR擴增陽性的患者血清或者腦脊液未能分離到菌株的進行MLST；健康攜帶情況調查及在全國范圍的、長期的流行情況調查時所有菌株進行PFGE，挑選代表菌株進行MLST分型。多位點可變數目串聯重復序列分析（MLVA）也是一種分子分型技術，其分型依據為VNTR位點的滑鏈突變。該方法具有較好的分辨力、重復性、分型力及可比性，操作簡單，試驗周期為1d。SHAN等［24］應用MLVA技術分析了序列型為ST－4821的C群Nm引起的2010年中國山東省的流腦疫情暴發。2000年日本學者發明了恒溫核酸擴增技術，即環介導等溫擴增技術（LAMP）。

近年來該技術已成功地應用于流腦、SARS、禽流感、HIV等疾病的檢測中。LEE等［25］應用LAMP技術對腦脊液中的Nm進行了快速鑒定，結果表明，該方法靈敏度高（比傳統的PCR方法高2～5個數量級），反應時間短（30～60min就能完成反應）。蛋白質組學技術是從蛋白質水平進行生命科學研究的新方法。有疾控工作者用該方法初步探索了Nm部分蛋白表型特征分析。胡源等［26］利用雙向電泳技術與質譜結合的蛋白質組學技術對66株C群Nm菌株及2株參考菌株的部分外膜蛋白和sucD蛋白表型進行分析，根據外膜蛋白和sucD蛋白將實驗菌株共分為9型，其中安徽菌株分型結果顯示出了高度的一致性，而其他地區菌株分型分布則顯示出高度的多態性，結果對認識安徽省流腦的流行規律和有效進行流腦疫情的防控具有重要意義。綜上所述，Nm的實驗室檢測技術涉及傳統的病原學檢測技術、免疫學ELISA及不斷更新的分子生物學方法，如PCR、熒光定量PCR、多重PCR、LAMP技術、MLVA分型、MLST技術、PFGE分型、蛋白質組學技術等。Nm的分子生物學方法比傳統病原學檢測法具有更高的特異性和靈敏度。當然各種技術并非單一的，實際工作中可能相互融合，以更好地優化Nm的檢測分析。新的方法也有其不足之處，如LAMP因靈敏度高，容易形成氣溶膠污染，由于國內大多數實驗室不能嚴格分區，假陽性問題可能比較嚴重，因此，引物設計要求比較高，有些疾病的基因可能不適合使用LAMP；蛋白質組學技術中2－DE技術還不成熟，現在有更新的色譜質譜聯用法取代2－DE和質譜鑒定法，對蛋白質的鑒定更準確，將更好地服務于疾病預防控制工作中。

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作者：廖春艷綜述；李志峰；段剛；審校 單位：重慶市疾病預防控制中心