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《分析儀器雜志》2016年第5期

摘要：

建立了凝膠滲透色譜凈化高效液相色譜法檢測食用菌類中呋喃丹農(nóng)藥殘留量的方法。樣品經(jīng)乙腈提取，氮?dú)獯蹈桑h(huán)己烷－乙酸乙酯（1∶1，V／V）溶液溶解后，凝膠滲透色譜進(jìn)行凈化，C18反相高效液相色譜柱分離后，采用液相色譜熒光檢測器進(jìn)行測定，外標(biāo)法定量。呋喃丹在0．2～5．0ng／mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r大于0．999，測定低限為0．01mg／kg。對空白食用菌樣品進(jìn)行3個濃度水平0．5、1．0和2．0mg／kg的加標(biāo)回收試驗(yàn)，呋喃丹的加標(biāo)回收率為78．3％～97．6％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3．26％～11．69％。本實(shí)驗(yàn)所建立的方法簡單，靈敏度高，適用于食用菌樣品中的呋喃丹農(nóng)藥殘留的分析檢測。

關(guān)鍵詞：

高效液相色譜；食用菌；呋喃丹；凝膠滲透色譜

1引言

呋哺丹屬于氨基甲酸酯類農(nóng)藥，是一類應(yīng)用廣泛的殺蟲、殺螨、除草劑，由于其具有高效、殘留期短的優(yōu)點(diǎn)，在食用菌種植中廣泛應(yīng)用［1］。目前國內(nèi)外對該類農(nóng)藥殘留有很嚴(yán)格的要求，食用菌中最低為0．1mg／kg［2］。因此，建立食用菌中快速、準(zhǔn)確、簡便、靈敏度高的呋喃丹殘留檢測方法十分必要。在氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析中，樣品凈化有GPC凈化［3－6］、SPE凈化［7－11］及傳統(tǒng)的液－液分配［12－14］和柱層析法［15］。GPC凈化具有結(jié)果重現(xiàn)性好、凈化效率高等優(yōu)點(diǎn)，為提高工作效率，節(jié)省人力，目前越來越多的檢測機(jī)構(gòu)選擇采用GPC凈化等新型凈化方式取代傳統(tǒng)的液－液分配和柱層析法。但目前各標(biāo)準(zhǔn)中的GPC凈化均為離線GPC，即在樣品萃取后，需要實(shí)驗(yàn)人員手動轉(zhuǎn)移，凈化、濃縮等一系列操作后，轉(zhuǎn)移至GC／MS進(jìn)行分析。采用全自動凝膠凈化色譜及濃縮聯(lián)用系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)GPC和濃縮同時進(jìn)行，自動化操作，簡化操作步驟，避免有機(jī)污染［16］。本實(shí)驗(yàn)選擇8種有代表性的蔬菜為研究基質(zhì)，建立了GPC凈化、高效液相色譜檢測的測定方法，方法簡便快速、凈化效果好，可滿足食用菌中呋喃丹殘留的檢測要求。

2材料與方法

2．1儀器與試劑

HPLC－1260液相色譜儀（美國安捷倫公司）配熒光檢測器（G1321B）；全自動凝膠凈化色譜及濃縮聯(lián)用系統(tǒng)（美國J2Scientific公司）；氮吹儀（英國TECHENE公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司）；渦旋混勻器（美國ScientificIndustries公司）；食品粉碎機(jī)（中國歐科電器公司）。呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)溶液：100μg／mL，購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所。乙腈、甲醇（色譜純，Merck公司）；環(huán)己烷、乙酸乙酯（分析純，國藥集團(tuán)）；無水硫酸鈉（分析純，上海久億化學(xué)試劑有限公司）；0．22μm有機(jī)系濾膜（天津東康科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為Millipore超純水。

2．2試驗(yàn)方法

2．2．1溶液配制

呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確移取100μL的呋喃丹農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇做溶劑，配制成10μg／mL儲備液，－20℃保存。使用時根據(jù)呋喃丹對應(yīng)響應(yīng)值，吸取適量儲備液，用甲醇配制成濃度為0．2ng／mL、0．5ng／mL、1．0ng／mL、2．0ng／mL、5．0ng／mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，供高效液相色譜測定。乙酸乙酯－環(huán)己烷（1∶1，V／V）：取500mL乙酸乙酯，加入環(huán)己烷500mL混勻。

2．2．2樣品處理

①試樣制備采集有代表性的8種食用菌樣品，取可食部分，經(jīng)縮分后，切碎，充分混勻后放入食品粉碎機(jī)粉碎，制成待測樣品。分裝后置于－20℃下保存，待提取。②提取稱取25．00g（精確到0．01g）粉碎的食用菌樣品，加入50mL乙腈，高速勻漿2min后用濾紙過濾。濾液收集到裝有5～7g氯化鈉的具塞量筒中，收集濾液40～50mL，蓋上塞子。劇烈振蕩lmin，在室溫下靜置10min，使乙腈相和水相分層。吸取10mL乙腈溶液在80℃水浴中氮吹干。加10mL已配好的乙酸乙酯－環(huán)己烷（50＋50）溶解殘渣，經(jīng)無水硫酸鈉脫水，待GPC凈化。③凈化GPC凈化條件：流動相乙酸乙酯－環(huán)己烷（50＋50，V／V），流速為4．6mL／min，選擇性收集10～20min流出液，經(jīng)GPC在線濃縮，最后用2．0mL甲醇－水（體積比5∶5）溶解殘渣，收集至進(jìn)樣瓶，過0．22μm有機(jī)濾膜，待測。

2．2．3色譜參考條件

色譜柱：C18（安捷倫，4．6mm×25cm，5μm）；C18預(yù)柱（4．6mm×4．5cm）。柱溫：35℃。激發(fā)波長285nm；發(fā)射波長320nm。流動相：甲醇－水（1∶1，V／V）。

3結(jié)果與分析

3．1色譜條件優(yōu)化

3．1．1流動相的選擇

有實(shí)驗(yàn)研究采用乙腈－水作為流動相，但乙腈毒性較高，對色譜柱損傷大。本實(shí)驗(yàn)以甲醇－水為流動相，以甲醇與水混合溶液的體積比（分別為30∶70、40∶60、50∶50）為條件進(jìn)行測試，甲醇比例較低時，保留時間延長，峰面積減小，結(jié)果表明甲醇－水體積比為50∶50時，樣品的出峰時間、峰形、靈敏度較適宜，與文獻(xiàn)報道一致。呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

3．1．2檢測波長選擇

取呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)使用液在2．2．3條件下進(jìn)樣，在波長200～900范圍內(nèi)對呋喃丹進(jìn)行多發(fā)射和多激發(fā)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)呋喃丹在激發(fā)波長320nm和發(fā)射波長為285nm處最強(qiáng)。故方法選定320nm為發(fā)射波長，285nm為激發(fā)波長。

3．1．3柱溫的選擇

研究中固定其他色譜條件，將色譜柱溫度從20℃升至40℃，結(jié)果顯示呋喃丹保留時間逐漸提前，為有效確保柱效及色譜柱使用壽命，方法采取柱溫35℃。

3．2GPC條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用GPC作為無損的半自動凈化方法，選用Bio－BeadsS－X3（300mm×10mm）作為填料。選用體積比為1∶1的乙酸乙酯－環(huán)己烷為流動相，設(shè)定流速為4．6mL／min，分段采集。實(shí)驗(yàn)中，為確定呋喃丹收集步驟，采用加標(biāo)樣品通過GPC紫外檢測器，紫外掃描數(shù)據(jù)顯示目標(biāo)化合物集中在9min至13min，故收集此段時間內(nèi)提取液（圖2）。實(shí)驗(yàn)中采用草菇樣品加標(biāo)樣品經(jīng)GPC凈化，檢測結(jié)果顯示，經(jīng)GPC凈化后雜質(zhì)干擾成分明顯減少，目標(biāo)化合物檢測靈敏度提高，同樣其他食用菌樣品也能得到較好的凈化效果。以草菇為例，見圖3、圖4。

3．3線性關(guān)系及檢測

限呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)工作液系列，按方法的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣，以所得峰面積A對濃度C（μg／mL）進(jìn)行回歸分析，結(jié)果表明在0．2～5．0μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍內(nèi)，呋喃丹濃度與響應(yīng)值有良好的線性關(guān)系（圖4），其回歸方程為：Y＝6．179X－0．2884；相關(guān)系數(shù)r＝0．9993。根據(jù)色譜響應(yīng)值S／N≥3標(biāo)準(zhǔn)計算，呋喃丹最低檢出濃度為0．01mg／kg。

3．4精密度實(shí)驗(yàn)

以呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)溶液5．0μg／mL，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，測得呋喃丹平均峰面積為30．96，RSD為0．108％。

3．5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

以標(biāo)準(zhǔn)溶液5．0μg／mL，每隔2h進(jìn)樣，每次10μL，測得呋喃丹平均峰面積為30．81，RSD為0．131％。結(jié)果表明：供試品溶液在12h內(nèi)所測得的結(jié)果基本一致。

3．6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一加標(biāo)食用菌樣品6份，按2．2．2的方法制成供試溶液。在上述色譜條件下，測定呋喃丹平均含量為1．78μg／kg，RSD為1．58％。

3．7方法回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取陰性樣品進(jìn)行低濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。該陰性樣品中加標(biāo)0．50、1．00、2．00μg／kg，回收率在78．3％～97．6％之間，RSD在3．26％～11．69％之間。

4結(jié)論

采用全自動凝膠凈化色譜及濃縮聯(lián)用系統(tǒng)處理樣品，可以有效去除大部分色素及干擾物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本方法具有凈化效果好、檢測限低、操作簡單、實(shí)用等特點(diǎn)，有效避免有機(jī)污染，可用于市場常見食用菌的呋喃丹農(nóng)藥殘留量的測定研究，適用于基層單位開展呋喃丹的監(jiān)測分析，具有廣泛的應(yīng)用前景。

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作者:馮曉青 汪怡 王芹 王露 宋鑫 徐瑞 杭學(xué)宇 單位:淮安市疾病預(yù)防控制中心