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摘要：微塑料(100nm~5mm)作為一種新型環境污染物,具有潛在的動植物和人體健康風險,其污染已成為高度關注的全球環境問題.當前已有不少關于微塑料在水生生物體內積累的報道,但對于陸地生態系統的研究則相對匱乏,高等植物對微塑料的吸收和積累更未見報道.本文基于室內培養實驗報道了微塑料在生菜(Lactucasativa)體內的吸收、傳輸及分布.通過激光掃描共聚焦熒光顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察發現,聚苯乙烯微球(0.2μm)可被生菜根部大量吸收和富集,并從根部遷移到地上部,積累和分布在可被直接食用的莖葉之中.研究結果為開展土壤-植物系統中微塑料積累機制及食物鏈傳遞與健康風險研究提供了新依據.

關鍵詞：微塑料,生菜,聚苯乙烯微球,吸收,積累,健康風險

塑料污染正在成為地球表層生態系統最嚴重的威脅之一[1].微塑料(100nm~5mm)是一種新型全球環境污染物,近年來受到國內外廣泛關注.原生微塑料[2]主要是指人為制造具有特定用途的粒徑<5mm的塑料顆粒,如工業磨料或塑料微珠等,它大量存在于日常生活中使用的一些洗滌用品以及個人清潔用品中.次生微塑料源自于外力作用下較大塑料碎片的碎裂,如塑料碎片、纖維等.微塑料粒徑小、數量大、分布廣且可作為污染物的載體,易被生物所攝食并且能在食物鏈中積累,從而可能會對生態系統和人體健康產生不利影響.目前,有關微塑料的研究多集中于海洋、海岸、河口、湖泊等水域生態系統[3~5].陸地環境是微塑料污染的重要源頭和主要匯集地,如污水、污泥和有機肥的施用,塑料薄膜的使用以及大氣沉降等均可能導致土壤微塑料的累積[6~8].有研究估算了每年排放到歐洲和北美農田的微塑料分別達到了110000和730000噸[9].這一數字甚至超過了海洋表面水體的年均微塑料增加量[10].關于土壤微塑料污染問題已成為近年來全球關注的熱點,亟需開展其含量、來源、遷移轉化、生態環境效應及健康風險等方面的系統研究工作.已有大量關于水生生物積累微塑料的報道,特別是在海洋生物中[11~14],這些研究表明微塑料在水生食物鏈中已無處不在.有關微塑料在土壤生物中累積及其效應的研究則相對匱乏,尤其是高等植物的研究更是鮮見報道[15~17].高等植物作為人類和動物賴以生存不可或缺的重要組分之一,也是人類和動物的主要食物來源之一,它對保持生態系統平衡起到了至關重要的作用.值得關注的是,亞微米甚至納米微塑料顆粒有可能被植物吸收、蓄積、生物放大、生物轉化,但目前還缺乏證據.微塑料一旦被可食植物吸收,將有可能通過多種暴露途徑導致在生物體和人體中的累積,從而對生物體和人類健康產生潛在不利影響.研究微塑料在植物(尤其是可食用作物)的吸收、積累對于其生態環境與健康風險評估具有重要意義.生菜(Lactucasativa)是一種在全球范圍被廣為直接食用的綠葉蔬菜.聚苯乙烯則是在光學、電子和化妝品等不同領域廣泛使用的塑料聚合物之一,同時也是在陸海環境中經常被檢出的微塑料污染物類型[1].本研究在實驗室培養試驗條件下,利用熒光標記的不同尺寸的聚苯乙烯微球,通過激光共聚焦顯微鏡(con-focallaserscanningmicroscopy,CLSM)和掃描電子顯微鏡(scanningelectronmicroscope,SEM)觀察,研究了其在生菜體內的吸收、輸移、積累和分布.

1材料與方法

1.1塑料微球本研究采用0.2和1.0μm的不同熒光標記的兩種聚苯乙烯塑料微球(紅色和綠色熒光),其均購自天津大鵝科技有限公司.微塑料顆粒呈球形,平均粒徑分別為0.23±0.04μm和0.98±0.09μm(圖1(a),(b)),在水相中分散、保存,本實驗儲備液濃度為10mgmL−1.微球在被激發后可觀察到高亮度熒光,且具有良好的穩定性,在溶液中未發現染料泄露(圖S1(a),(b)).從紅外光譜表征圖可以明顯看出聚苯乙烯的特征峰(圖S2).兩種微球水動力學直徑分別為0.27±0.04μm和1.5±0.2μm.其表面帶負電荷,Zeta電位分別為−42.7±0.9mV和−13.1±0.6mV.

1.2供試生菜及生長條件生菜(LactucasativaL.,Rosa)種子由中國農業科學院提供.挑選飽滿大小一致的種子,先用0.5%NaClO溶液浸泡處理10min,進行表面滅菌.隨后用去離子水將種子洗滌3次,以洗去殘留的NaClO溶液.將種子置于濕潤的濾紙上,在20℃下,避光催芽2d.種子萌發后在泥炭土中生長21d.然后將生菜幼苗取出洗凈,轉移到Hoagland營養液中,在人工氣候室25±2℃,12꞉12h光照꞉黑暗和70%相對濕度條件,繼續培養生長7d.Hoagland營養液組成為:2.5mmol/LCaNO3和KNO3,10μmol/LFeEDTANa2,0.1mmol/LK2HPO4,75μmol/LKCl,10μmol/LH3BO3,1mmol/LMgSO4,4μmol/LMnCl2•4H2O,0.5μmol/LCuSO4•5H2O,1μmol/LZnSO4•7H2O和0.2μmol/LNa2MoO4•2H2O.

1.3吸收富集實驗將紅色和綠色熒光標記的聚苯乙烯微球儲備液超聲分散3min后,與Hoagland營養液混合,再超聲分散一次,配制成50mgL−1聚苯乙烯微球暴露試驗液.本試驗設置兩種粒徑(0.2和1.0μm)處理,每個處理4個重復,每個盆缽(1L)移入兩株生菜苗.移栽后的幼苗在人工氣候室繼續生長14d.暴露液每隔2d更換一次.暴露結束后,借助激光共聚焦顯微觀察(FluoViewFV1000,奧林巴斯,日本)和掃描電子顯微鏡(S-4800,日立,日本)觀察植物體內微球的積累與分布狀況.

1.4激光共聚焦顯微鏡觀察收集吸收富集實驗中新鮮生菜根、莖和葉,用超純水充分清洗干凈后,選取根(成熟區)、莖(距莖的基部2cm)和葉柄,包埋于4%低熔點瓊脂糖中.使用振動切片機(VT1200S,徠卡)將根、莖和葉分別切成40和100μm厚的半薄切片,置于載玻片上,滴加磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebufferedsaline,PBS)用蓋玻片封片.使用激光共聚焦掃描顯微鏡在激發/發射波長分別為488/515nm和635/680nm進行觀察.每個樣品至少重復3次.圖像的后處理經導入成像軟件FluoviewFV10完成.

1.5掃描電子顯微鏡觀察收集并清洗吸收富集實驗的生菜苗,分別取根和葉,進行掃描電子顯微鏡觀察.取材位置與激光共聚焦顯微觀察位置相同,切成小塊并在液氮中冷凍.然后將樣品冷凍干燥,并借助sputtercoater(cressingtonmodel108,TedPellaInc.,美國)用金涂覆60s(約1nm厚的金),用于掃描電子顯微鏡觀察.在具有反向散射檢測的高真空模式下,在20kV的加速電勢下觀察橫截面.以不同的放大率捕獲圖像.每個樣品至少重復3次.

2結果

2.1微塑料在生菜中的吸收與分布研究塑料微球進入植物體內及其在植物體內積累和轉運狀態對認識其作用影響至關重要.在利用熒光標記聚苯乙烯微球的試驗中,未發現微米級(1.0μm)微球能被生菜吸收(圖2(a)~(f)),這表明在本實驗條件下微米級聚苯乙烯微球難以通過生菜根系細胞間隙的自由空間和質外體屏障進入根系皮層甚至中柱.本文主要探討了亞微米級(0.2μm)聚苯乙烯微球在生菜體內的吸收、累積和分布.紅色熒光微球,由于可避免生菜根部自身背景熒光干擾,在本研究中被用來示蹤微球在生菜根部的蓄積.植物根冠可以分泌大量黏液來保護植物免受病原體攻擊[18].熒光微球處理生菜根尖具有明顯肉眼可見“深綠色”(熒光標記微球的顏色),表明塑料微球能被生菜根冠分泌的黏液(高度水合多糖)捕獲并黏附在根表面.對照組生菜根橫切和縱切圖中未觀察到熒光(圖S3).從熒光微球處理組生菜根的橫切(圖3(a)~(c))和縱切(圖3(d)~(f))切片圖可以看出,大量熒光存在于細胞壁的間隙中,表明聚苯乙烯微球能夠進入到生菜根里面.此外,還發現聚苯乙烯微球能夠到達中柱.在進入中心圓柱體后,塑料微球就可以在根壓和蒸騰拉力的作用下隨蒸騰流和營養流通過木質部向地上部分移動[19,20].

2.2微塑料在生菜體內的遷移綠色熒光微球,由于可避免生菜莖和葉組織自身背景熒光干擾,被用來研究微球向生菜地上部遷移.對照組生菜莖和葉中未觀察到熒光(圖S3).激光共聚焦顯微照片顯示,生菜在根部積累大量聚苯乙烯微球后,通過維管組織可將少量微球輸運到莖和葉的脈管系統中(圖3(g)~(l)).為驗證聚苯乙烯微球能被生菜吸收和轉運,生菜根葉組織切片被用來在掃描電子顯微鏡下進一步觀察.掃描電子顯微鏡照片證明了微球在生菜根部大量存在,在維管組織中彼此黏附在一起呈現“葡萄”或“鏈條”聚集狀(圖4(c),(f)),在葉片組織中微球粘連在一起呈分散狀(圖4(i)).

3討論與結論

陸地環境微塑料來源廣泛,產生量大,由于尚缺乏統一的土壤和土壤孔隙水微塑料分析檢測標準方法,其在土壤中濃度難以估測.目前已有不少關于農業土壤中微塑料污染的報道[8,9],但仍無法確定其實際暴露水平.需要指出的是由于很難從實際環境中分離出足夠量的微塑料用于其生態環境效應的評價,本研究選用不同尺寸的亞微米級聚苯乙烯微珠模擬微塑料污染,指示了高等植物的可吸收和積累性.由于聚合物類型、尺寸、表面性質和形狀等的差異,商品化的微塑料可能與環境中微塑料存在一定差異.未來的研究不僅包括微珠或近似球形的塑料顆粒,還應包括環境中經常檢測到的纖維和其他形狀塑料顆粒[21].此外,未來需進行更接近微塑料環境濃度和環境條件的暴露實驗,以此來評估其對生態系統的真實影響.值得關注的是,可直接食用高等植物生菜是受國內外消費人群喜愛的綠葉蔬菜之一,同時也是世界上無土栽培的常見蔬菜之一.本試驗研究證明,生菜不僅可吸收微塑料,而且可將其運輸、積累和分布在莖葉之中.因而,在實際生產過程中,特別是當無土栽培的營養液受微塑料污染時,很有可能產生生菜農產品安全風險,繼而通過食物鏈影響人體健康,因而需要引起重視.無土栽培過程中營養液可能會受到塑料裝置、塑料大棚以及大氣沉降等影響受到微塑料污染.與有土栽培介質相比,微塑料在水溶液中移動性更強,在蒸騰拉力作用下更加容易積累到植物體內.不同作物或者蔬菜由于根系分泌物、細胞壁空隙度、蒸騰速率和根系水力傳導率等影響因素的差異,其吸收富集微塑料顆粒的能力也可能存在差異,需要進一步進行比較研究.目前已有不少關于植物對金屬和碳基納米顆粒吸收轉運的研究報道[22,23],而微塑料由于其較強的黏附性和可形變性,更容易被植物黏附并吸收到體內,進而產生潛在的生態和健康風險.可食作物中微塑料的積累,還可能會增加人體對塑料中添加化學品(包括可浸出添加劑和黏附污染物)的直接暴露,并可能進一步對人類健康造成危害.需要指出的是目前尚缺乏食品中微塑料含量、膳食暴露以及微塑料對人體毒性的基礎數據,其健康風險評估方法也亟需建立.未來應亟待加強微塑料顆粒及其添加劑和黏附污染物毒性的研究和基礎數據積累.本文報道了生菜吸收、傳輸和積累微塑料的研究成果,可為研究高等植物對微塑料的吸收和積累機制及生態效應提供科學依據,對于評估土壤中微塑料對農作物及蔬菜的潛在安全及健康風險具有重要意義.基于更細小的微塑料更易被生物吸收,因而未來需要加強對亞微米甚至納米微塑料在食用性作物中積累和食物鏈傳遞機制研究,并關注其對生態系統和人體健康的影響.

作者：李連禎 周倩 尹娜 涂晨 駱永明 單位：中國科學院煙臺海岸帶研究所