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第1篇

關鍵詞：低次煙葉；蛋白質-多酚復合物；酶解；抗氧化性

中圖分類號：S572 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）03-0531-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.03.035

Analysis of Composition and Antioxidant Activity of Protein-polyphenol Complex from Discarded Tobacco Leaves

XU Chun-ping1，RAN Pan-pan1，ZENG Ying1，TAN Lan-lan2，SHENTU Hong-qian2，MA Kuo-yan3，DAI Ya3

（1.College of Food and Biological Engineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002，China；

2.Technical Center of China Tobacco Chuanyu Industrial Co. Ltd.， Chengdu 610066，China；

3.Technical Center of China Tobacco Chongqing Industrial Co. Ltd.， Chongqing 400060，China）

Abstract： The protein-polyphenol complex was extracted from discarded tobacco leaves by alkali-solution and acid-isolation method. The protein content was detected as 350 mg/g and polyphenol components including chlorogenic acid， scopoletin and rutin， and their contents were 2.1 mg/g， 0.5 mg/g， and 2.9 mg/g， respectively. The antioxidant tests of protein-polyphenol complex showed that in a certain range， the scavenging rate of DPPH? radical and OH? radical increased with the increase of the concentration. The scavenging activity of DPPH? radical and OH? radical was decreased with the time of enzymatic hydrolysis. The results indicated that the antioxidant activity of protein-polyphenol can maintain with the binding stage of protein and polyphenol， and the main source of antioxidant activity could be from polyphenols.

Key words： discarded tobacco； protein polyphenol complex； enzymatic hydrolysis； antioxidant activity

中是煙草種植大國，也是卷煙生產大國，同時每年產生的低次煙葉也數量龐大，有效利用這些廢料既可以保護環境，減輕環境負擔，也能創造更高的經濟價值。煙葉蛋白質是一種優質的蛋白質資源，作為食用蛋白質來說它比雞蛋、乳酪和牛奶更適合人體吸收利用，具有較高的營養價值和藥用價值[1]。Kung等[2]、Lowe[3]對煙葉FI蛋白質進行了提純。趙謀明等[4]使用堿溶酸沉法工藝對煙葉蛋白質進行提取。研究表明，提取出的蛋白質是一種蛋白質多酚復合物[5]，其中多酚成分對其生物活性有較大影響。林曉婕等[5]從煙葉中提取出色素蛋白質復合物，表明其中多酚物質對其抗紫外活性起主要作用。王潔[6]研究表明，蛋白質與多酚以非共價形式結合。本試驗對提取的蛋白質-多酚復合物的組成進行分析，檢測其抗氧化活性，并分析其組成對抗氧化活性的影響，以期為煙葉蛋白質的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

低次烤煙葉粉末（2013年河南襄縣產豫煙10號X3L等級煙葉）。濃鹽酸、Tris、無水乙醇、磷酸、DPPH、鄰二氮菲、PBS磷酸鹽、硫酸亞鐵、H2O2（30%）以上試劑均為分析純；甲醇、乙酸為色譜級；綠原酸、蕓香苷、莨菪葶為標準品（Sigma公司）；中性蛋白酶（200 000 U/g）、堿性蛋白酶（200 000 U/g）（江蘇銳陽生物科技有限公司）；考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白（西安國安生物科技有限公司）；回流裝置、水浴鍋、低速離心機（湘儀TDZ5-WS型）、紫外分光光度計（UV1700PC型）、Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、色譜柱為Waters Symme-try C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質-多酚復合物的提取 按照堿溶酸沉法提取低次煙葉蛋白質-多酚復合物[4，7]，低次煙葉打粉過篩，按料液比1∶30（m∶V，下同）加入去離子水，將pH調至8，在50 ℃溶解30 min，以3 000 r/min離心15 min，取上清液調pH至3，酸沉1 h，再3 000 r/min離心15 min得到沉淀，冷凍干燥即為蛋白質-多酚復合物。

1.2.2 蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[8]。標準曲線的繪制：準確配制100 μg/L的標準牛血清蛋白溶液，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用去離子水補至1 mL，然后加入考馬斯亮藍G-250 5 mL，搖勻，放置5 min，在585 nm下比色測定吸光度。以蛋白質濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

樣品檢測：準確稱取冷凍干燥后的蛋白質-多酚復合物0.1 g，將樣品稀釋1 000倍，取1 mL用考馬斯亮藍法測定其吸光度，方法同上，通過標準曲線及稀釋倍數計算蛋白質含量。計算公式為蛋白質含量（mg/g）=（蛋白質濃度×稀釋倍數/1000）/0.1。

1.2.3 蛋白質-多酚復合物中多酚含量的測定 用HPLC對低次煙葉蛋白質-多酚復合物中多酚含量進行測定。準確稱取1.00 g蛋白質復合物，加入150 mL 80%甲醇，回流40 min，取1 mL，通過0.22 μm濾膜過濾，進樣[5]。

定性試驗：標準溶液為80%甲醇配制的0.1 mg/mL綠原酸、0.005 mg/mL莨菪葶、0.1 mg/mL蕓香苷。設置3個試驗，標準樣品為1號，樣品組為2號，樣品組加入0.1 mL標準樣品為3號，進行試驗。

外標標準曲線的繪制：將配制好的綠原酸分別取1.2、1.0、0.8、0.6、0.4 mL定容到10 mL，相同條件下進樣；將上述莨菪葶、蕓香苷也分別取1.2、1.0、0.8、0.6、0.4 mL定容到10 mL進行測定。多酚含量計算方法：多酚含量（mg/g）=多酚濃度×150。

色譜條件：流動相A為水∶甲醇∶乙酸=88∶10∶2（體積比），流動相B為水∶甲醇∶乙酸=10∶88∶2（體積比）。柱溫30 ℃，柱流量1 mL/min，進樣體積20 μL。梯度0 min，流動相A 為100%；16.5 min，A為80%，B為20%；30 min，A為20%，B為80%。檢測器為DAD，檢測波長340 nm，參比波長480 nm，分析時間40 min[9]。

1.2.4 煙葉蛋白質-多酚復合物抗氧化能力的測定 采用DPPH法測定低次煙葉蛋白質-多酚復合物對DPPH?自由基的清除能力[10]。采用鄰二氮菲法測定低次煙葉蛋白質-多酚復合物對OH?自由基的清除能力[11]。

1.2.5 酶解蛋白質-多酚復合物的抗氧化性測定 用中性蛋白酶和堿性蛋白酶1∶1的混合酶，在60 ℃、pH=7、加酶量0.001 g的條件下，對樣品進行酶解，每20 min取一次樣，對酶解液進行抗氧化性檢測，方法同上。

1.3 數據處理

采用SPSS Statistics17.0統計軟件進行統計學分析，均數比較采用Student-t檢驗，顯著性水平P

2 結果與分析

2.1 蛋白質-多酚復合物中蛋白質含量

以蛋白質濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，如圖1所示。由標準曲線得到線性方程y=0.009 8x+0.044 2，R2=0.992 8。測得稀釋后的樣品吸光度為0.387，由方程及稀釋倍數得到蛋白質-多酚復合物中蛋白質含量為350 mg/g。

2.2 蛋白質-多酚復合物中多酚的檢測

采用HPLC檢測蛋白質-多酚復合物中多酚，結果如圖2所示。樣品中3種成分與標樣中物質保留時間相似，通過標準加入法進一步說明該物質與標樣中物質相同，根據保留時間依次為綠原酸、莨菪葶、蕓香苷，其比例與烤煙煙葉中游離態多酚比例相似[10]。

以不同濃度的標樣進行外標標準曲線測定，外標標準曲線方程分別為綠原酸y=3×10-5x（R2=0.992 1）、莨菪葶y=1×10-5x（R2=0.995）、蕓香苷y= 4×10-5x（R2=0.991 3），通過方程得到綠原酸濃度為0.014 0 mg/mL，莨菪葶濃度為0.003 3 mg/mL，蕓香苷濃度為0.019 0 mg/mL，從而計算出蛋白質-多酚復合物中多酚含量分別為2.1、0.5、2.9 mg/g。

2.3 蛋白質-多酚復合物的抗氧化能力

2.3.1 蛋白質-多酚復合物對DPPH?自由基的清除能力 對于不同蛋白質-多酚復合物濃度及不同水解程度進行DPPH?自由基清除試驗，樣品稀釋為蛋白質濃度3.5、4.4、5.8、8.8、17.5、35.0、70.0、116.7、175.0 μg/mL。從圖3可以看出，蛋白質-多酚復合物在較低濃度時就可清除DPPH?自由基，在3.5～35.0 μg/mL，蛋白質-多酚復合物對DPPH?自由基的清除效率與蛋白質-多酚復合物濃度呈劑量-效應關系，也就是隨著低次煙葉蛋白質-多酚復合物濃度的增加，對DPPH?自由基的清除率增大（P0.05）。

用蛋白酶對蛋白質-多酚復合物進行酶解，其對DPPH?自由基的清除效果如圖4所示。隨著酶解時間的延長，蛋白質-多酚復合物中蛋白質的水解程度越高，對DPPH?自由基的清除活性呈下降趨勢（P

2.3.2 蛋白質-多酚復合物對OH?自由基的清除能力 對不同蛋白質-多酚復合物濃度及不同水解程度進行OH?自由基清除試驗，將樣品稀釋為蛋白濃度分別為3.5、4.4、5.8、8.8、17.5、35.0、43.8、58.5、87.5、175.0、350.0、700.0 μg/mL，樣品蛋白質-多酚復合物中蛋白濃度與清除羥基自由基的能力如圖5所示。與蛋白質-多酚復合物清除DPPH?自由基的清除效果相似，在較低濃度時，蛋白質-多酚復合物就可清除羥基自由基，在4.4～175.0 μg/mL時，隨著蛋白質-多酚復合物濃度的升高，對羥基自由基的清除率也升高（P0.05）。

采用蛋白酶酶解蛋白質-多酚復合物，隨著酶解時間的延長，蛋白質-多酚復合物中蛋白質水解程度增大，對OH?自由基的清除率呈下降趨勢（P

3 小結

堿溶酸沉法提取低次煙葉中蛋白質-多酚復合物，對其進行成分分析，其蛋白質含量為350 mg/g，多酚中綠原酸2.1 mg/g，莨菪葶0.5 mg/g，蕓香苷2.9 mg/g。對其進行抗氧化性檢測，結果表明，其抗氧化活性隨著蛋白質-多酚復合物濃度增大而增大，蛋白質酶解后隨著酶解時間的增加抗氧化活性降低，表明蛋白質-多酚復合物中抗氧化活性可能主要來源于與其非共價結合的多酚，且在結合的狀態下才能保持蛋白復合物的抗氧化活性。

參考文獻：

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[4] 趙謀明，饒國華，林偉鋒，等.低次煙葉中蛋白質提取工藝優化及氨基酸分析研究[J].農業工程學報，2006（1）：142-146.

[5] 林曉婕，傅 紅，楊 琳，等.煙草色素蛋白復合物中多酚類物質對其抗紫外性能的影響[J].中國煙草科學，2011（2）：57-61.

[6] 王 潔.多酚-蛋白質相互作用的影響因素及其功能特性研究進展[J].河南工業大學學報（自然科學版），2012（3）：91-96.

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[8] BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem，1976，72：248-254.

[9] YC/T 202-2006，煙草及煙草制品多酚類化合物綠原酸、莨菪葶和蕓香苷的測定[S].

[10] 勾明h， 梁，張春枝.采用DPPH法測定26種植物的抗氧化活性[J].食品與發酵工業，2010（3）：148-150.

[11] 付林林，郭玉華.六種中藥抗羥自由基活性研究[J].安陽工學院學報，2010（4）：26-27.

第2篇

隨著語料庫語言學的發展，詞塊在語言習得中的作用受到了越來越多的重視。許多研究表明，以詞塊為基本單位的詞匯學習能夠提高詞匯習得效率，提高語言輸出的正確度與流利度。鑒于藝術班學生相對較弱的英語語言功底，筆者認為增加藝術班學生的有關教材單元話題的詞塊儲備量和加強學生的相關詞塊生成能力是開展高三英語藝術班學生詞匯復習的有效途徑。

1. 理論簡介

詞塊是介于單詞和句法之間的單位，是一些兼有詞匯和句法特征的半固定或固定化表達。詞塊具有較穩定的語義、結構和較固定的語用功能，它們的使用往往與一定的語境相聯系。因此，詞塊是語法、語義和語境的結合體，具有很強的語言生成力。以詞塊為基本單位的詞匯學習，有利于學生記憶和儲存語言知識，符合學生的認知規律和語言習得規律。可以說詞塊是搭建英語“高樓”的“預制板”，高三學生應該在教師的指導下提取、感知、內化詞塊，達到輸出的自動化。

2. 詞塊輸入的途徑

教師以多種途徑指導學習者輸入詞塊，可以改變學習者英語言語活動的“自然”狀態，改變學習者過多采取與母語言語活動相關策略、對言語過程注重信息傳達而較少注意英語語言本身的現狀，促進學習者詞匯的積累并能夠輸出優質語句。

2.1 教材詞塊輸入

高三英語一輪復習以基礎知識復習為核心。藝術班學生英語基礎薄弱，這要求教師在進行一輪詞匯復習時要回歸教材。在紛繁復雜的詞匯世界里，教師需要引導學生對教材模塊1-8甚至模塊9和10里的單元的詞塊內容，按照相關話題重新進行梳理、提取和誦讀。語義場理論認為要構成一個完整的詞匯系統，語言系統中的詞匯在語義場上必須是相互聯系的。Crow和Quigley（1985）研究發現，英語作為第二語言的高年級學生用語義場記住的詞匯比背誦詞匯表記住的詞匯多一倍。因此，以“單元話題”為主線幫助學生構建話題詞匯的語義場是一種科學而有效的做法。以下是筆者指導任教班級學生從第六模塊的第二單元提取的相關“happiness”話題詞塊：

（1） a day without suffering 沒有痛苦的一天

（2） devote herself to gymnastics 致力于體操運動

（3） cost her future happiness 把她未來的幸福華為泡影

（4） in good spirits 精神狀態良好

（5） The secret to happiness is to do...幸福的秘絕是……

筆者指導學生提取和歸納閱讀文章中的詞塊的同時，要求學生誦讀詞塊。誦讀詞塊是一種積極的語言輸入過程。學生依托課文中的語言情境，對輸入詞塊進行觀察、感知和分析，為以后的應用做準備。例如，學生想要表達“把未來的幸福華為泡影”，就不會按照母語思維去編造語言，而能很快提取出誦讀過的詞塊。

2.2 一輪復習材料的詞塊輸入-《藝考之路》

《藝考之路》屬于南方鳳凰臺系列，與教材相配套，主要針對高三藝考生。 書中不僅收錄了從模塊一到模塊八的常見單詞、詞組和句式而且每個單元都收錄一個契合話題的范文。筆者要求學生背誦書中的常見單詞和詞組，背誦重點句子和范文。尤其是范文，學生通過背誦不僅擴大了詞塊量，而且學會了寫相關話題的書面表達，完全符合語義場理論，與教材達到了前后呼應的效果，大大提高了一輪復習的效率。以下是筆者在《藝考之路》范文積累板塊找到的好句子：

（1）正是這些奮斗和障礙提升了我們的毅力，使我們走向成功。

It is these struggle and obstacles that increase our willpower and contribute to our success.

（2）溫室里的花朵永遠不能抵抗風暴。

Flowers from a greenhouse can never withstand a storm.

（3）我愿意使他遭受生活中的艱難困苦而不是一味地保護他，使他免受于困難。

I would expose him to the hardships in life instead of protecting him from difficulties.

（4）首先，清潔工不得不一大早就開始清潔工作，甚至在日出之前，為本地市民提供干凈的環境。

To begin with， the cleaners have to start the cleaning early in the morning， even before the sunrise， to provide a clean surrounding for the local citizens.

2.3 語料庫詞塊輸入-《新課標英語詞匯》

《新課標英語詞匯》作為我校高中生必備的自主學習詞匯用書收錄了《普通高中英語課程標準（實驗）》列出的八級目標即高考要求掌握的3500個單詞，增補了約1000個使用頻率高的單詞和500個高考要求掌握的習慣用語或固定搭配，標注了高考詞頻標和考頻，收錄了教材原句，精選高考例題，鏈接高考真題。該書是一本很適合高三學生使用的語料庫。

筆者在每天的課堂中會結合一輪復習資料-《藝考之路》，帶著學生根據筆者提出的重點詞在《新課標英語詞匯》中查找并要求學生摘抄常用的搭配并要求學生背誦相應的例句。除此之外，筆者會定期從中挑一些句子，讓學生背誦。第二天，筆者會根據布置的背誦任務，抽查這些句子。學生通過抄寫，背誦和默寫這三個程序逐漸豐富了自己的詞塊知識，讓學生熟悉英語中約定俗成的表達和固定的詞語搭配，獲得真正的英語語感。

2.4 模擬試卷詞塊輸入

高三學生做的模擬卷也是很好的語料。單項、完形、閱讀、任務型閱讀里蘊含著豐富的詞塊知識。讓學生最大化利用這些詞塊、積累一些使用頻率高的詞塊是筆者需要做的事情。筆者要求每位學生準備一本摘抄本用來摘抄試卷中使用頻率高的表達法及長難句，并要求學生每天朗誦并達到能熟練使用的目的。例如： rise from； withdraw from； recognition； desperately； cognition； break down； Most of them will be thrown away within two years， adding plastic， heavy mental and chemical waste to the environment. ； If you apply for a job position with a foreign company， chances are you will be asked to provide an English cover letter along with your resume。

3. 結論

教師要利用各種不同的途徑，圍繞話題，幫助學生積累詞塊。同時，教師要不斷創造詞塊輸出的機會，加強學生詞塊輸出的訓練，及時反饋學生詞塊使用情況并給予指導，使學生的詞塊輸出達到熟練的程度，并最終讓學生書面表達語句實現準確性、流暢性和得體性。 單項選擇；句子翻譯、多譯、句型轉換；不限時寫作；限時寫作等等都是較好的詞塊輸出練習。通過這些練習，學生不僅能夠檢查自己掌握詞塊的熟練程度，并能夠在成功使用詞塊的過程中增強他們學習英語的興趣和信心。

筆者正在自己所帶的藝術班進行相關的教學實踐。詞塊的積累需要師生較多的前期投入，但是因為藝術班學生要花相當多的時間學習藝術專業，他們在詞塊積累方面欠缺很多。所以，學生需要付出相當大的努力才能建立詞塊輸入和輸出意識，形成詞塊積累、運用、鞏固的良性循環。

參考文獻

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[2] 楊春玲， 周斌. “語義場理論對中學英語詞匯教學的啟示”[J]. 中小學外語教學， 2009（07）.

[3] 吳繼琴. “基于單元話題的高三英語詞匯復習”[J]. 中小學英語教學與研究， 2015（09）.

第3篇

關鍵詞：高三英語；復習課；復習效率

高考英語在不斷進行著改革發展，教師在教學過程中要根據高考改革的方向制訂適合學生復習的學習計劃等，將學生放在復習學習計劃的主體地位，根據所教班級的實際情況，制訂合適的復習計劃，幫助學生鞏固已經學到的英語基礎知識，增強學生的英語實踐能力。

一、采用合適的方法加強學生英語詞匯記憶

英語語言的基礎是詞匯量，學生只有掌握大量的英語詞匯量，才能夠在此基礎上進行更好的英語學習。很多學生認為背誦英語單詞是枯燥無聊的，因此在高三復習課堂上，教師要從學生的角度出發，將學生放在主體地位，為學生著想，采用適合學生的復習方法指導學生背誦英語單詞，如：教師在英語復習課上可以采用詞匯記憶游戲幫助學生背誦英語單詞。通過游戲，可以使學生高三的復習課程充滿樂趣，緩解學生面臨高考的壓力，還能夠加深學生對英語單詞的印象。因此，教師在復習課上采用合適的教學方法，能夠提高高三英語復習課的復習效率。

二、教師和學生都要制訂復習計劃

任何復習工作要想順利進行，都要在之前制訂一個良好的計劃，按照計劃一步一步實施，才能最終完成總目標。教師在進行復習課教學前要制訂一定的復習計劃，根據所教班級學生的實際情況制訂復習計劃，教師在復習課上按照計劃指導學生進行復習，這樣有計劃性的復習課堂才是高效的。除了教師要制訂復習計劃，教師還應當讓學生根據自己的課余時間制訂屬于學生自己的復習計劃。這樣在課堂上學生跟著教師制訂的復習計劃進行復習，在課余時間，根據自己制訂的復習計劃自主進行復習。

生本教育的理念是：一切為了學生、高度尊重學生、全面依靠學生。提高高三英語復習課效率，需要教師將學生放在主體地位，一切為學生著想，尋找適合學生的復習方法。

參考文獻：