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《中國調味品雜志》2014年第七期

1醋蛋液酶解反應

1．1酶的篩選實驗本試驗選用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，在各酶最適pH、溫度、相同的添加量（E／S）對醋蛋液進行酶解反應，酶解物的DPPH•自由基清除率作為篩選最佳蛋白酶的指標。

1．2胃蛋白酶酶解醋蛋的單因素試驗在酶解過程中，pH值、溫度、時間和酶濃度對反應速度影響較大，通過實驗確定適當的參數才能獲取高活性的酶解產物。由于每一種酶都具有最適宜的pH值和溫度范圍，故本實驗以DPPH•自由基清除率為指標對酶的添加量、酶解時間及底物濃度進行單因素分析，確定影響胃蛋白酶解的三個因素最適作用條件。

1．3酶解反應的正交試驗考慮底物濃度、酶量和反應時間這3個因素，各因素水平見表1和表2。

2結果與分析

2．1蛋白酶活力

2．1．1標準曲線的制作首先以DL－酪氨酸作標準曲線。利用最小二乘法得到DL－酪氨酸濃度X（1μg／mL）與吸光度Y（OD680）之間的回歸方程為：x＝100y－0．87。該方程R2＝0．9997，比色常數K＝100，符合酶活力測定的要求。酪氨酸溶液濃度與吸光值的關系標準曲線見圖1。

2．1．2酶活力測定采用福林酚法酶促反應10min，測定不同蛋白酶的樣品的吸光值，通過酶活計算式算出的5種蛋白酶的活力見表3。由表3中酶活數據可知，各種蛋白酶的酶活力具有較大差異，這是因為不同來源的蛋白酶其酶學特性不同，而且酶作用位點的專一性不同，針對相同的底物，其酶活力會有差異。研究表明：動物蛋白比植物蛋白容易酶解，而植物蛋白質中存在阻礙酶作用的結構，限制蛋白酶解，所以要對醋蛋白的水解用酶進行篩選，篩選出酶解產物抗氧化活性強、水解效率高的酶制劑。

2．1．3蛋白酶的篩選在醋蛋水解過程中蛋白酶的選擇是關鍵，它不僅影響最后產品的得率、反應速度，而且直接影響產品的風味和理化特性。蛋白水解物的生理活性取決于所用原料醋蛋的氨基酸序列、蛋白酶種類和醋蛋水解度的大小。本試驗選取胃蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對醋蛋液進行水解反應，以此來比較酶種類對醋蛋液作用的差異。不同蛋白酶對醋蛋液水解度的影響：在4種蛋白酶的最適溫度、最適pH值條件下酶解10h，相應的酶與底物的濃度比［E］／［S］為8000U／g、底物濃度［S］為1％。不同蛋白酶對醋蛋液水解度的影響見圖2．由圖2可知，在酶解約480min后，醋蛋液的Al－calase酶解物、胃蛋白酶酶解物、胰蛋白酶酶解物的水解度分別達到其最大水解度的1／2，而木瓜蛋白酶酶解物對醋蛋液的水解作用很小。原因是蛋白酶酶學特性不同、來源不同，水解作用差異較大。在4種酶的酶解進程中，因為Alcalase堿性蛋白酶和胃蛋白酶的酶活力高、溶解性好、專一性強等特點，所以水解過程比較理想。

2．1．4醋蛋液的不同蛋白酶水解物對二苯代苦味肼基自由基（DPPH•）的清除能力在酶與底物的濃度比［E］／［S］為8000U／g、底物濃度［S］為1％，在胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶4種蛋白酶各自的最適條件下水解8h，反應結束后，檢測產物對DPPH•的清除率，結果見圖3。由圖3可知，4種蛋白酶的水解物都具有體外抗氧化作用，其中抗氧化作用最強的是胃蛋白酶酶解產物，其次是堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解物。由此可見，醋蛋液經4種蛋白酶水解后都具有體外抗氧化活性的肽段，但各種酶的特異性肽段的種類和數量不相同，因而具有不同的體外抗氧化活性。由試驗結果可以看出，胃蛋白酶酶解產物對DPPH•的清除能力較強，在醋蛋的酶解過程中具有較高的酶活力和穩定性。而疏水性氨基酸－COOH是堿性蛋白酶的切割位點，這就造成它酶解產物中會產生很多游離的疏水性氨基酸和末端為疏水性氨基酸的多肽，使得水解液苦味最大。而胃蛋白酶水解多肽的苦味程度較小，疏水性氨基酸從肽鏈中部移向末端，使苦味有所減弱，另外選擇胃蛋白酶作為醋蛋液的水解用酶是模擬人體生物酶，成本低、來源廣泛，適于工業化生產中使用，因此確定醋蛋液的最佳水解用酶為胃蛋白酶。

2．2胃蛋白酶單因素試驗結果分析

2．2．1底物濃度對醋蛋液抗氧化性的影響胃蛋白酶在酶與底物之比為8000U／g、反應時間8h、pH2．0、溫度37℃的條件下，分別對底物濃度為0．8％，1．5％，2．0％，2．8％的醋蛋溶液酶解，測定酶解產物對DPPH•的清除率，結果見圖4。由圖4可知，底物濃度在0．8％～2．8％范圍內的醋蛋液抗氧化活性變化情況，酶底物濃度較低時清除率較小，隨著底物濃度的增加，抗氧化性呈現上升的趨勢。當底物濃度大于2．0％時，酶底物濃度再增加，抗氧化性基本不變，可能是由于醋蛋液的濃度過大比較黏稠、粘度增大，降低了酶解液的水分活度，影響蛋白酶擴散，對水解反應有抑制作用，所以底物濃度取值范圍為1．5％～2．8％，這樣可以提高酶解效率。

2．2．2酶用量對醋蛋液抗氧化性的影響由圖5可知，酶用量在8000～14000U／g范圍內醋蛋液抗氧化性變化情況，隨著酶用量的增加，抗氧化性呈現下降的趨勢。當酶用量為8000U／g時，醋蛋液抗氧化性達到最高。在底物濃度一定的條件下，濃度越大則酶與底物之間作用幾率越大、越頻繁，當酶量的增加使酶的數量過剩時，單位時間內多余的酶分子不與底物結合，水解程度增加在圖表上表現變平緩的趨勢。另外，酶本身是一種蛋白質，酶解底物的同時自身也會發生酶解，酶用量太大會干擾酶解物的生成。從成本上考慮，酶試劑價格較貴，過量添加成本較高。因而，在酶解時選擇最佳的酶用量為6000～10000U／g。

2．3正交試驗設計優化工藝流程根據單因素的最適水解條件，底物濃度（1．5％～2．8％），酶與底物濃度比（6000～10000U／g），研究酶底物比、底物濃度對酶解產物抗氧化性的影響，通過單因素試驗確定取值范圍。以酶解產物對DPPH•的清除率為指標，選用三因素三水平正交組合，以確定最佳酶解條件。通過酶解產物對DPPH•的清除率數據進行分析，建立DPPH•清除率與底物濃度、酶底物比和酶解時間的數學模型，并確定最優條件體系下DPPH•的清除率。正交試驗方案結果見表4。由表4可知，通過回歸正交試驗結果確定胃蛋白酶的最佳水解條件是A2B2C3，即底物濃度2％，酶底物濃度比8000U／g，酶解時間為8h，實驗數據中5號實驗結果67．1％最高抗氧化數據，也正是在A2B2C3酶解條件下所獲得的。

2．4抗氧化性比較在相同條件下，不同的酶解產物抗氧化大小不同，實驗選取醋蛋液水解物、麥胚蛋白水解液和WPI乳清分離蛋白水解物與純品Vc抗氧化性比較，實驗結果見表5。由表5可知，各種酶解物抗氧化大小不同，其中醋蛋的胃酶酶解的抗氧化性達到67．10％，證明醋蛋酶解物具有的抗氧化性與其它酶解物相比較高，極具研究價值。

3結論

本試驗選取兩種動物蛋白酶（胃蛋白酶和胰蛋白酶）、一種微生物蛋白酶（Alcalase堿性蛋白酶）和一種植物蛋白酶（木瓜蛋白酶），對醋蛋液進行水解反應，以此來比較酶種類對醋蛋液作用的差異及水解效果。在底物濃度［S］為1％、酶與底物的濃度比［E］／［S］為8000U／g，分別在4種蛋白酶的最適溫度、最適pH值條件下酶解10h。實驗結果表明，胃蛋白酶是醋蛋液的最佳水解用酶。采用二苯代苦味肼基自由基（DPPH•）體系研究各酶水解物的抗氧化活性，確定酶解產物的抗氧化活性最強酶類。實驗結果表明：4種蛋白酶的水解物均有體外抗氧化作用，但對DPPH•自由基的清除率有較大差異，其中具有較強清除自由基能力的是胃蛋白酶，其DPPH•自由基的清除率高達61．1％。由此可知，醋蛋液酶解產物具有較強清除自由基能力，即具有良好抗氧化活性。其酶解產物的抗氧化活性最強酶類是胃蛋白酶。通過正交試驗確定胃蛋白酶的最佳水解條件：底物濃度2％，酶底物濃度比8000U／g，酶解時間為8h，在此條件下酶解產物對DPPH•的清除率為67．1％。實驗在相同的條件下比較醋蛋液、麥胚蛋白、WPI乳清分離蛋白與純品Vc抗氧化性比較，實驗結果表明，醋蛋水解物的抗氧化性最高。

作者：陳黎斌劉巖成世盈許曉娜陳自立何國盛單位：廣東食品藥品職業學院